AVALIAÇÃO DO EFEITO HORMONAL

Em nosso experimento, a avaliação do efeito hormonal foi efetuada através de três parâmetros bastante utilizados na literatura, a citologia vaginal, o peso uterino e a dosagem hormonal. Além destes parâmetros classicamente utilizados, avaliamos também o efeito hormonal dos esteroides sexuais a partir da observação das alterações na morfologia mamária.

A citologia vaginal baseia-se na resposta do epitélio vaginal ao estímulo hormonal, principalmente estrogênios e progesterona. Tal observação é considerada um meio indireto de avaliação da função ovariana e do estado hormonal do indivíduo (LUSTOSA et al. 2002). Em nosso experimento, este parâmetro foi utilizado com sucesso a fim de avaliar o efeito hormonal do AH, das TH e da menopausa cirúrgica.

Observamos que a utilização de AH causa alterações no padrão de citologia vaginal em que se verifica a presença de agrupamentos de células profundas, com aspecto similar ao que normalmente é visto na fase de proestro, além de muco, células epiteliais isoladas de todos os tipos – profundas, intermediárias, superficiais, escamas – e leucócitos, que normalmente são vistos na fase de metaestro. O que se nota é que a utilização de AH faz com que as ratas parem de ciclar e apresentem um padrão citológico semelhante a uma mistura das fases de proestro e metaestro, o que nós chamamos de EH do AH (EH-AH). Este foi um dos parâmetros utilizados neste trabalho para confirmar que o AH estava atuando nas ratas.

A mistura do aspecto citológico é absolutamente compatível com o que se sabe a respeito dos hormônios que atuam nas diferentes fases do ciclo estral, já que durante o proestro observa-se alta concentração de estrogênio e na fase de metaestro há uma alta concentração de progesterona (FATA et al. 2001). Estes hormônios são os que estão presentes no AH, por isso a combinação de aspectos citológicos destas duas fases está de acordo com o esperado.

O tratamento dos animais somente com os hormônios de TH, nos levou ao mesmo resultado já visto por outro trabalho do nosso grupo usando T, que é a citologia similar a estro permanente (HENRIQUES et al. 2010b). Este resultado indica que o tratamento foi efetivo e as doses utilizadas foram adequadas para se alcançar um efeito hormonal. Já nos animais que receberam AH durante a vida reprodutiva e, posteriormente receberam TH, o padrão citológico se mostrou variado de acordo com o hormônio utilizado, indicando que ainda havia influência do AH, impedindo que os animais apresentassem o padrão de estro permanente desde o início do tratamento com TH como é observado normalmente. Os animais pl+OVX+pl permaneceram com citologia vaginal em anestro até o final do experimento, comprovando a ausência de influência hormonal após a retirada dos ovários.

Sabe-se que o estrogênio induz substancial aumento do fluxo de sangue uterino (RAO et al. 1995) e edema estromal (GAETE et al. 2002; RAO et al. 1995; CHAVES et al. 1993). Além disso, ocorrem mudanças na permeabilidade vascular o que torna possível o aparecimento do edema (RAO et al. 1995). Também, o estradiol causa acúmulo de fluido dentro do lúmen uterino (GRUNERT et al. 1987).

Este acúmulo no lúmen ocorre normalmente durante o ciclo estral nas fases de proestro e estro, em resposta ao estrogênio endógeno (ROCKWELL et al. 2002), promovendo distensão da luz uterina (CLEMETSON, 1977). Este acúmulo não ocorre no diestro, isto porque o canal cervical das ratas é fechado por uma ação semelhante a um esfíncter durante o estro, mas se abre durante o diestro, permitindo o escape do líquido acumulado (CLEMETSON, 1977). O uso de estradiol

induz edema uterino tanto em ratas intactas quanto em ratas OVX (STEINSAPIR et

al. 1982). Sabe-se que após a OVX, as ratas apresentam redução dos níveis de

estrogênio e, por isso, o útero destes animais não apresenta edema tecidual nem intracavitário.

Os cornos uterinos se tornam vazios após a ooforectomia e voltam a se distender, com um fluido semelhante ao encontrado no estro após a administração de estrogênio. Já altas doses de progesterona administradas com o estrogênio bloqueiam essa secreção e causam reabsorção do líquido da cavidade, promovendo a redução do líquido acumulado (CLEMETSON, 1977).

Em nosso experimento, os animais que receberam tratamento com AH apresentaram edema uterino intracavitário. Este edema variou ligeiramente de acordo com a TH utilizada na pós-menopausa. Este se mostrou moderado nos animais que receberam TH com T e E2 (AH+OVX+T e AH+OVX+E2) e leve naqueles que receberam TH com E2Pg (AH+OVX+E2Pg), indicando que o uso do E2Pg combinados na pós-menopausa efetivamente reduz o edema causado pelo uso de E2 isolado. Além disso, estes resultados mostram que a T também é capaz de levar ao edema do lúmen uterino, possivelmente por ação estrogênica nos vasos sanguíneos nesse órgão-alvo. Os animais que apresentaram maior edema luminal foram os AH+SHAM+pl, o que é esperado, pois houve atuação inicialmente do AH e depois dos hormônios endógenos que continuaram atuando. Os animais que receberam AH e foram OVX, sem receber TH (AH+OVX+pl), também apresentaram edema leve. Isso indica que o AH permanecia com algum efeito uterino, mesmo após a realização da cirurgia. Estes dados também mostram que a associcão do progestógeno ao estrogênio do AH não foi suficiente para reverter o acúmulo de líquido intracavitário uterino, como é indicado na literatura. Os animais que não receberam AH durante a vida reprodutiva apresentaram edema moderado (pl+OVX+T), leve (pl+OVX+E2Pg) ou ausência de edema uterino (pl+OVX+E2 e pl+OVX+pl), indicando que o maior responsável pelo acúmulo de líquido intracavitário no útero foi o uso de AH, sem haver grande redução deste líquido por parte do componente progestógeno. Em concordância com nossos resultados,

Grunert e Tchernitchin (1982) observaram que a progesterona induziu uma reação edematosa leve no estroma endometrial de ratas e, além disso, o pré-tratamento com progesterona de animais tratados com estrogénio não bloqueou o edema uterino induzido por estrogênio.

O estrogênio aumenta a permeabilidade vascular no útero de roedores, conduzindo a edema estromal (ROCKWELL et al. 2002), além de causar aumento na proliferação epitelial (RAO et al. 1995). Consequentemente, ocorre um aumento do peso uterino de ratas. Estas alterações também ocorrem no útero humano nas fases secretória e proliferativa (ROCKWELL et al. 2002). Por isso, o efeito do uso dos hormônios esteroides em ratas pode ser avaliado mediante a observação do peso uterino.

Sabe-se que o peso uterino é um bom parâmetro para analisar a ocorrência da menopausa cirúrgica em ratas. Nestes casos, é observada uma redução do peso uterino em comparação com o grupo sham operado (LUDGERO- CORREA et al. 2012; HAO et al. 2010; TORREZAN et al. 2008; YOSHITAKE et al. 1999). Ocorre, após tratamento com estradiol, um retorno ao peso normal (HAO et

al. 2010; HENEWEER et al. 2007; YOSHITAKE et al. 1999; RAO et al. 1995), o que

também é observado após o tratamento com tibolona (YOSHITAKE et al. 1999). Entretanto, em estudo com coelhos, o etinil estradiol apresentou efeito uterotrófico mais forte do que a tibolona. Este resultado indica que a tibolona tem um menor efeito sobre o útero quando comparado ao estrogênio, o que se dá, possivelmente, pela seletividade da droga (ZANDBERG et al. 2001).

Os trabalhos normalmente não especificam como foi realizada a pesagem do útero (seco ou molhado) e, na maioria das vezes, relacionam o efeito uterotrófico ao aumento da camada epitelial. Entretanto, a geração de edema também pode ser um importante fator para o aumento do peso uterino em animais tratados com hormônios exógenos, sejam eles de AH ou de TH. Assim, novos estudos devem ser realizados a fim de entender os mecanismos através dos quais os hormônios são capazes de causar edema uterino e qual seria esta implicação para a clínica.

Outra metodologia utlizada para verificação do efeito hormonal foi a dosagem dos níveis séricos de estradiol e progesterona. A avaliação destes hormônios é comumente realizada nos trabalhos que fazem uso de hormônios esteroides, mas é um parâmetro de difícil comparação com dados pré-existentes, uma vez que há uma variedade enorme de protocolos experimentais, cada um deles utilizando diferentes hormônios, em diferentes concentrações e formas de administração. Além disso, o protocolo por nós realizado (uso de TH seguido ao uso de AH) é inédito e, por isso, não existem dados para que haja uma comparação direta. Por isso, decidimos fazer uma análise dos resultados levando em consideração a fase compatível com o ciclo estral em que os animais se encontravam após os tratamentos hormonais administrados.

Assim, nossos resultados estão de acordo com Sjahfirdi et al. (2011) que descreve um pico de estradiol durante o proestro e outro menor no estro, fato que foi observado por nós, embora o valor obtido no estro foi apenas ligeiramente superior aos valores obtidos em metaestro e anestro. Entretanto, devemos levar em consideração que nossas ratas não estão ciclando normalmente, mas sim, sob o efeito hormonal em que a rata apresenta uma citologia compatível com uma das fases do ciclo estral natural. Por isso, algumas discrepâncias podem ser ressalvadas. Sjahfirdi et al. (2011) observou dois picos de progesterona, um no início do diestro e outro ligeiramente superior no proestro. Em nosso trabalho, os níveis de progesterona apresentaram variabilidade entre os grupos, sendo o maior valor exatamente nos animais com citologia similar a proestro. Naqueles cuja citologia mostrava EH-AH, a dosagem de estradiol foi muito baixa e a de progesterona foi alta, o que é compatível com os hormônios que compõem o fármaco, já que nele, a concentração do agente progestogênico é superior ao agente estrogênico.

O efeito hormonal também pode ser observado a partir das alterações vistas no padrão morfológico e de secreção da mama destes animais. Observamos que o tratamento com AH na vida reprodutiva acarreta alterações muito visíveis principalmente com relação à secreção mamária e ao desenvolvimento da glândula. Estes animais apresentaram ramificação ductal progressiva e ductos e ácinos cheios

de secreção quimicamente neutra, com gotículas de gordura, semelhante ao que é observado na mama em lactação; este padrão foi similar nos animais que receberam quer seja pl ou TH na pós-menopausa.

Já os animais que só receberam TH, também apresentaram modificações no padrão morfológico mamário quando comparados aos animais pl+OVX+pl. As mamas das ratas pl+OVX+pl apresentavam padrão atrófico e sem secreção, o que foi modificado pelo uso das TH.

Estes resultados indicam que os hormônios esteroides utilizados neste protocolo experimental – dose, via de administração e frequência – foram efetivos em determinar efeitos sistêmicos, o que foi comprovado a partir da citologia vaginal, peso uterino (efeito uterotrófico), dosagem hormonal e alteração da morfologia mamária.