Avaliação do potencial de produção de enzimas hidrolíticas extracelulares

Para avaliação do potencial de produção de enzimas hidrolíticas extracelulares, foram realizados testes qualitativos em meio sólido. Os resultados foram expressos em Indices Enzimáticos (IE), que correspondem à razão entre o diâmetro do halo e o diâmetro da colônia. Todas as amostras foram testadas em triplicata.

4.2.3.1 Produção do inóculo para os ensaios em meio sólido

Para a avaliação do potencial de produção de enzimas hidrolíticas extracelulares, as leveduras foram reativadas das culturas estoques, repicadas pela técnica do esgotamento em placas contendo ágar Sb e incubadas a 25-28ºC por 48 horas. Decorrido esse tempo, as colônias foram transferidas com o auxílio de uma alça descartável para tubos de ensaio contendo 2 mL de salina esterilizada formando uma suspensão. A concentração de células foi padronizada por meio da escala de McFarland nº1, correspondente à presença de 3 x 108 UFC/mL para leveduras.

38 4.2.3.2 Amilases

A habilidade de degradar amido foi usada como critério para determinação da produção de enzimas amilolíticas (HANKIN & ANAGNOSTAKIS, 1975). Os ensaios foram realizados em meio sólido contendo 1% de amido solúvel, 0,67% de YNB e 2% de ágar. A placa com meio de cultura foi dividida em seis partes, onde foram aplicados 10 µL da suspensão de células de levedura. Os cultivos foram incubados a 28ºC por 120 horas e, ao final deste período, a revelação foi realizada pela sublimação de iodo depositado nas tampas das placas. A atividade amilolítica extracelular foi avaliada pela medição da zona clara formada ao redor da colônia utilizando um paquímetro. O restante do meio permaneceu corado de violeta (HANKIN & ANAGNOSTAKIS, 1975).

4.2.3.3 Celulases

A habilidade de degradar carboximetilcelulose foi usada como critério para determinação da produção de enzimas celulolíticas (TEATHER & WOOD, 1982). Os ensaios foram realizados em meio sólido contendo 1% de carboximetilcelulose, 0,67% de YNB e 1,5% de ágar. Para o preparo deste meio, a carboximetilcelulose foi homogeneizada com o auxílio de um liquidificador. A placa com meio de cultura foi dividida em seis partes, onde foram aplicados 10 µL da suspensão de células de levedura. Os cultivos foram incubados por 120 horas a 28°C e a revelação foi realizada adicionando-se 5 mL de uma solução aquosa de vermelho Congo a 0,03% às placas inoculadas. Decorridos 15 minutos após esse procedimento, as placas foram lavadas com uma solução de NaCl 1M. A hidrólise da carboximetilcelulose foi evidenciada pela formação de um halo de coloração clara ao redor da colônia (TEATHER & WOOD, 1982). A atividade celulolítica extracelular foi avaliada pela medição da zona clara formada ao redor da colônia utilizando um paquímetro.

4.2.3.4 Pectinases

A habilidade de degradar pectina cítrica foi usada como critério para determinação da produção de enzimas pectinolíticas (BRIZZIO et al., 2007). Os

39 ensaios foram realizados em meio sólido contendo 1% de pectina cítrica, 0,67% de YNB e 1,5% de ágar. Para o preparo deste meio, a pectina foi homogeneizada com o auxílio de um liquidificador e autoclavada separada do ágar. A placa com meio de cultura foi dividida em seis partes, onde foram aplicados 10 µL da suspensão de células de levedura. Os cultivos foram incubados por 120 horas a 28°C e a revelação foi realizada pela sublimação de iodo depositado nas tampas das placas. A hidrólise da pectina foi evidenciada pela formação de um halo de coloração clara ao redor da colônia (BRIZZIO et al., 2007). A atividade pectinolítica extracelular foi avaliada pela medição da zona clara formada ao redor da colônia utilizando um paquímetro.

4.2.3.5 Xilanases

A habilidade de degradar xilana foi usada como critério para determinação da produção de enzimas xilanolíticas (BHADRA et al., 2008). Os ensaios foram realizados em meio sólido contendo 1% de xilana, 0,67% de YNB e 2% de ágar. A placa com meio de cultura foi dividida em seis partes, onde foram aplicados 10 µL da suspensão de células de levedura. Os cultivos foram incubados por 120 horas a 28°C e a revelação foi realizada adicionando-se 5 mL de uma solução aquosa de vermelho Congo a 0,03% às placas inoculadas. Decorridos 15 minutos após esse procedimento, as placas foram lavadas com uma solução de NaCl 1M. A hidrólise da xilana foi evidenciada pela formação de um halo de coloração clara ao redor da colônia (BHADRA et al., 2008). A atividade xilanolítica extracelular foi avaliada pela medição da zona clara formada ao redor da colônia utilizando um paquímetro.

4.2.3.6 Proteases

A habilidade de degradar caseína foi usada como critério para determinação da produção de enzimas proteolíticas (DUARTE et al., 2013). Os ensaios foram realizados em meio sólido contendo 2,5% de SkimMilk base (fonte de caseína), 0,1% de glicose, 0,5% de peptona, 0,3% de extrato de levedura, 0,3% de extrato de malte e 1,5% de agar. Para o preparo deste meio, a base SkimMilk foi autoclavada separadamente dos demais componentes do meio e, após autoclavados, as

40 soluções foram misturadas a 60ºC, antes da distribuição nas placas. A placa com meio de cultura foi dividida em seis partes, onde foram aplicados 10 µL da suspensão de células de levedura, e os cultivos foram incubados por 120 horas a 28°C. A hidrólise da caseína foi evidenciada pela formação de um halo translúcido ao redor da colônia (DUARTE et al., 2013). A atividade proteolítica extracelular foi avaliada pela medição da zona clara formada ao redor da colônia utilizando um paquímetro.

4.2.3.7 Lipases

A habilidade de degradar azeite de oliva foi usada como critério para determinação da produção de enzimas lipolíticas (COLEN, 2006). Os ensaios foram realizados em meio sólido contendo 1% de azeite de oliva; 0,5% de (NH4)2SO4; 0,2% de ureia; 0,1% de MgSO4.7H20; 0,1% de NaCl; 0,2% de sais biliares; 0,05% de extrato de levedura; e 1,5% de agar. Para o preparo deste meio todos os reagentes foram misturados e aquecidos até solubilização do agar e, posteriormente, a mistura foi homogeneizada com o auxílio de um liquidificador. A emulsão produzida pela mistura do azeite de oliva ao meio persiste mesmo após autoclagem. Dessa forma, foi possível obter um meio homogêneo para o ensaio qualitativo. A placa com meio de cultura foi dividida em seis partes, onde foram aplicados 10 µL da suspensão de células de levedura, e os cultivos foram incubados por 120 horas a 28°C. A hidrólise do óleo de oliva foi evidenciada pela formação de um halo translúcido ao redor da colônia (COLEN, 2006). A atividade lipolítica extracelular foi avaliada pela medição da zona clara formada ao redor da colônia utilizando um paquímetro.

4.2.4 Avaliação do potencial de produção de fatores promotores de