Avaliação do sêmen

A avaliação espermática é de extrema importância, uma vez que a qualidade do espermatozóide é essencial para a ocorrência da fertilização, seja ela natural ou artificial.

Segundo o Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (1998), esta avaliação pode ser dividida em características físicas, que compreendem volume, aspecto, movimento de massa, motilidade, vigor e concentração, e morfológicas, com a diferenciação de espermatozóides normais e anormais.

De acordo com Blom (1973), os espermatozóides anormais podem ser classificados em defeitos maiores e menores.

Podem-se incluir as seguintes avaliações: pH seminal, integridade do acrossoma (percentual de espermatozóides com acrossoma íntegro) e vitalidade espermática (percentual de espermatozóides vivos); e a motilidade pode ser classificada em espermatozóides móveis e espermatozóides com motilidade progressiva rápida e retilínea (HAFEZ, 1995; WHO, 1999; JANINI, PEREIRA, 2001).

A avaliação da integridade da membrana plasmática fornece importante informação com relação à permeabilidade da membrana e consequente viabilidade da célula (GRAHAM, 2001). Membranas plasmáticas íntegras impedem a entrada de moléculas grandes como corantes na célula, e, por este motivo, diversas técnicas podem ser utilizadas para esta avaliação (GRAHAM, 2001).

Nestas técnicas, espermatozóides com membrana plasmática íntegra, não são corados e são considerados vivos, e espermatozóides corados, portanto com membrana danificada são considerados mortos (GRAHAM, 2001; BJÖRNDAHL; SÖDERLUND; KVIST, 2003).

A viabilidade do espermatozóide de diversas espécies pode ser avaliada com a utilização de muitas técnicas de coloração espermática. Algumas têm sido largamente utilizadas, como a coloração com eosina Y (KUEDERLING et al., 2000; VALLE et al., 2004), trypan-blue (DIDION et al., 1989; KOVÁCS; FOOTE, 1992) e eosina 1% e nigrosina 10%, ambas em solução aquosa (HAFEZ, 1995; WHO, 1999; JANINI, PEREIRA, 2001; BJÖRNDAHL; SÖDERLUND; KVIST, 2003).

Para a avaliação da integridade do acrossoma existem diversas técnicas de coloração não fluorescente e fluorescente. A coloração simples para acrossoma de espermatozóide de felinos descrita por Pope, Zhang e Dresser (1991), e uma técnica de coloração pelo kit comercial SPERMAC^® (Stain Enterprises, África do Sul), uma coloração modificada da coloração Papanicolau (BARAN et al., 2004; CHAN et al.,

1996; OETTLE, 1986) são exemplos de colorações não fluorescentes para avaliação da integridade acrossomal. A coloração dupla por trypan-blue e giemsa pode ser utilizada para avaliação da vitalidade e integridade acrossomal em algumas espécies animais (DIDION et al., 1989; KOVÁCS; FOOTE, 1992), porém o corante giemsa não apresenta resultados satisfatórios para integridade acrossomal de espermatozóides humanos (CROSS; MEIZEL, 1989).

As colorações com sondas fluorescentes têm sido utilizadas para visualização da integridade acrossomal de espermatozóide do homem e de diversas espécies animais, inclusive primatas não humanos (CROSS et al., 1986; CROSS et al., 1989; CROSS; MEIZEL, 1989; ROTH et al., 1998), porém só foi relatada para Callithrix

jacchus por Pudritz (2000), com algumas modificações.

As lectinas se ligam aos glicoconjugados presentes na membrana acrossomal externa ou na matriz acrossomal (CROSS et al., 1986) e têm sido comumente utilizadas neste tipo de avaliação.

A FITC (Fluorescein isothiocyanite) -PNA (Peannut Agglutinin) conjugada é uma lectina de amendoim (Arachis hypogaea) utilizada para visualização da integridade acrossomal em espermatozóides humanos (MORTIMER; CURTIS; MILLER, 1987).

A FITC (Fluorescein isothiocyanite) –PSA (Pisum sativum agglutinin) conjugada pode ser utilizada para visualização da integridade acrossomal de espermatozóides humanos (CROSS et al., 1986), de primatas não humanos como macacos cynomolgus (Macaca fasciculares) (CROSS et al., 1989) e saguis de tufos brancos (Callithrix jacchus) (PUDRITZ, 2000).

Nestas duas colorações os espermatozóides com acrossoma íntegro apresentam fluorescência verde intensa.

A motilidade do espermatozóide é uma das principais características analisadas para a avaliação da qualidade espermática, porém alguns autores sugerem que não há correlação altamente significativa entre o percentual de espermatozóides móveis e a fertilidade (GRAHAM; SCHMEHL; NELSON, 1980; GRAHAM, 2001), embora com o advento de sistemas computadorizados para análise seminal a acurácia na aferição deste parâmetro tenha melhorado significativamente (GRAHAM, 2001).

A motilidade está diretamente relacionada à atividade mitocondrial (Amann, 1989). O movimento flagelar da cauda do espermatozóide é um dos principais fatores responsáveis pela sua motilidade e este fenômeno consome altas quantidades da energia gerada principalmente pela desfosforilação da adenosina tri-fosfato (ATP) (SALYSBURY; LODGE; VAN DEMARK, 1978) proporcionada pelas mitocôndrias (O´CONNELL; MCCLURE; LEWIS, 2002). Portanto, a redução do potencial da membrana mitocondrial com conseqüente diminuição da produção energética pode levar à perda da motilidade.

A análise da atividade citoquímica mitocondrial avalia a respiração celular e o metabolismo energético da célula por meio da citocromo c oxidase (HRUDKA, 1987). A citocromo c oxidase é uma enzima altamente correlacionada com o citocromo c, que é um produto da cadeia respiratória (HURDKA, 1987). A oxidação da 3,3’diaminobenzidina (DAB) pelo complexo citocromo c, incluindo a citocromo c oxidase, é uma reação em cadeia que resulta na polimerização do reagente comconsequente deposição nos locais da reação (membrana mitocondrial interna) (HRUDKA, 1987). Esta deposição pode ser identificada pela visualização de uma cor castanha na região da peça intermediária do espermatozóide.

• Classe I: quase todas as mitocôndrias estão ativas, ou seja, apresentam-se com coloração castanha dando à bainha mitocondrial a aparência de um cilindro compacto e proeminente.

• Classe II: a bainha mitocondrial aparece fragmentada, com segmentos ativos (corados) e inativos (não corados), porém com predominância de segmentos corados.

• Classe III: apresentam menos da metade da bainha mitocondrial ativa e corada com poucos segmentos corados e dispersos.

• Classe IV: apresentam bainha mitocondrial completamente inativa, totalmente não corada.

A taxa de fragmentação de DNA dos espermatozóides é um dos fatores determinantes nas taxas de fertilidade, onde espermatozóides com taxas mais altas de fragmentação de DNA resultam em taxas mais baixas de fertilidade (DURAN et al., 2002; BENCHAIB et al., 2003; LARSSON-COOK et al., 2003).

Existem diversos testes para detecção da taxa de fragmentação do DNA em espermatozóides (DURAN; MORSHELDI; TAYLOR, 2002; BENCHAIB et al., 2003; LARSSON-COOK et al., 2003). O ensaio Cometa alcalino é o teste mais sensível para avaliar estágios iniciais de fragmentação de DNA, pois é uma técnica que consiste na realização da eletroforese de célula única em gel de agarose para avaliação da fragmentação em fita total do DNA dos espermatozóides, onde fragmentos menores ou mais freqüentes são deslocados distâncias maiores nos géis (SINGH et al., 1988; DONNELLY et al., 2000).

Nesta técnica as células apresentam morfologia semelhante à de um cometa. A cabeça representa o arcabouço de DNA intacto e a cauda representa os

fragmentos originados pela quebra da fita de DNA que migraram durante a eletroforese (KLAUDE et al., 1996; DONNELLY et al., 2000).