4. RESULTADOS
4.5 Avaliação dos ensaios de high-throughput screening
Com as condições estabelecidas, os ensaios de high-throughput screening foram realizados com a biblioteca de compostos orgânicos da Spectrum Collection (MicroSource Discovery Systems, Gaylordsville, EUA).
De acordo com os critérios pré-estabelecidos, a varredura identificou 24 compostos com alta capacidade de inibição, cujos valores das suas velocidades iniciais estavam abaixo do valor médio do V0 do controle negativo, e menores do que
o valor médio de V0 do controle positivo, somado a 20 vezes o seu desvio padrão. A
tabela 6 apresenta os valores médios dos slopes dos controles obtidos na varredura, e seus respectivos desvios padrões. Ao contrário do ácido tânico, a hematoxilina provou-se um controle ineficiente, já que a inibição alcançou um valor de slope mais alto do que o esperado (2,428 ± 0,463 RFU/s). Por esta razão, apenas o ácido tânico foi utilizado para realização da triagem dos compostos.
Tabela 6: Velocidades iniciais (máx. slope) e desvios padrões (σ) dos controles no HTS.
Máximo slope (RFU/s) σ
Branco 0,02285 0,029280945
Controle negativo 6,020204 0,632338709
Ácido tânico 0,013193 0,023270803
Hematoxilina 2,428421 0,463057724
A figura 25 demonstra o gráfico resultante da cinética de cada um dos principais
hits encontrados. A conversão do substrato em produto foi detectada pelo aumento
da intensidade da fluorescência no intervalo de reação de 1 hora. Os inibidores foram selecionados de modo em que as suas unidades relativas de fluorescência (do inglês
relative fluorescence units, RFU) permanecessem constantes, ou seja, compostos da
biblioteca cujo valor de V0 não estivesse maior do que o valor médio de V0 do controle
positivo, somado a 20 vezes o seu desvio padrão. Dentre 2320 compostos, foram selecionados 24 que apresentaram maior atividade contra a NS2b-NS3pro do vírus do Nilo Ocidental. A tabela 7 indica seus respectivos valores máximos de V0.
Figura 25: Cinética enzimática dos ensaios de varredura da biblioteca com a protease NS2b-NS3 de WNV. 24 compostos + ácido tânico demonstraram inibição próxima ao branco. Condições: tampão de glicina pH 8,5, concentração de protease a 50 nM, substrato a 56 µM e inibidor (biblioteca) a 40 µM.
0,00 2000,00 4000,00 6000,00 8000,00 10000,00 12000,00 14000,00 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Fl uo res c ên c ia (R FU ) Tempo (s)
Branco Controle positivo
Ácido tânico Hematoxilina
Antralina Closantel
Brometo de tonzônio Entacapona
Epicatequina monogalato Epigalotequina-3-monogalato
Hemateína Iriginol hexaacetato
Teaflavina monogalato Ursololactona
Fisetina Gossipetina
Ácido nordi-hidroguaiarético Catacina
Ácido ursólico Plumbagina
2,3,4-tri-hidroxi-4'-etoxibenzofenona Ácido tetra-hidrogambógico
Quercetina Gossipol
Juglona Pirogalina
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Tabela 7: Velocidades iniciais (máx. slope) dos hits encontrados pelo HTS.
Composto Máx. slope (RFU/s) Composto Máx. slope (RFU/s)
Antralina 0,051773 Ácido nordi-
hidroguaiarético 0,0031348
Closantel 0,032152 Catacina 0,0047059
Brometo de
tonzônio 0,019608 Ácido ursólico 0,011774
Entacapona 0,004717 Plumbagina 0,25254 Epicatequina monogalato 0,001555 2,3,4-tri-hidroxi-4'- etoxibenzofenona 0,0078444 Epigalotequina-3- monogalato 0,025882 Ácido tetra- hidrogambógico 0,03215 Hemateína 0,13175 Quercetina 0,010983
Iriginol hexaacetato 0,019612 Gossipol 0,014895
Teaflavina monogalato 0,020385 Juglona 0,01412 Ursololactona 0,052543 Pirogalina 0,002401 Fisetina 0,072146 3,4-didesmetil-5- desidróxi-3'- etoxiscleroina 0,0072173
Gossipetina 0,010977 Fenetil cafeato
(CAFE) 0,010797
A tabela 8 apresenta os 24 compostos da biblioteca, mais os controles positivos ácido tânico e hematoxilina, uma pequena descrição sobre a molécula, e suas aplicações conhecidas até o momento. Os compostos podem ser tanto sintéticos quanto de origem natural, isoladas a partir de espécies vegetais, ou metabólitos secundários de microrganismos. A estrutura de cada composto está projetada na figura 26.
Tabela 8: Informações descritivas sobre os compostos orgânicos encontrados na varredura da biblioteca (Drugbank.ca. 2020; Pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/. 2020).
Composto Descrição Aplicação
Ácido tânico
Composto polifenólico pertencente a classe dos
taninos.
Possui efeitos antioxidante adstringente. Acredita-se que
exerça efeitos antivirais e antibacterianos.
Hematoxilina Composto orgânico polifenol
heterotetracíclico.
Corante mais utilizado em histologia, histoquímica,
histopatologia e em citologia.Também usado na
fabricação de tinta.
Antralina
Composto orgânico da classe dos antracenos. Contém um
sistema de três anéis de benzeno fundidos linearmente.
Derivado natural da antraquinona, agente anti- psoriático e anti-inflamatório.
Closantel
Amida aromática pertencente à classe dos salicilanilídeos
halogenados.
Possui atividade anti-helmíntica contra parasitas hematófagos,
agindo em diferentes tipos e estágios de desenvolvimento de trematódeos, nematóides e artrópodes. Brometo de tonzônio Composto orgânico pertencente à classe de
anisóis que contém um metoxibenzeno ou um de seus
derivados.
Possui propriedades surfactantes e detergentes, com
atividades antifúngicas e antibacterianas
Entacapona
Pertencente à classe de ácidos hidroxicinâmicos em
que o anel benzeno é hidroxilado.
É um inibidor seletivo e reversível da catecol-O-metil
transferase (COMT) para o tratamento da doença de
Parkinson.
Epicatequina monogalato
Pertence a uma classe de flavonoides conhecidos como
galatos de catequina, contendo uma porção galato
Proveniente do chá verde, possui potencial quimiopreventivo contra o
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ligada glicosidicamente a uma catequina.
Epigalotequina-3- monogalato
Pertence a uma classe de flavonoides conhecidos como
galatos de catequina, contendo uma porção galato ligada glicosidicamente a uma
catequina. Proveniente do chá verde, possui potencial quimiopreventivo contra o câncer. Hemateína Composto orgânico heterotetracíclico, membro dos
fenóis, derivado oxidado da hematoxilina.
Corante utilizado em histologia, histoquímica, histopatologia e
em citologia.
Iriginol hexaacetato
Derivado do iriginol, membro da família de produtos naturais
das isoflavonas.
Isoflavonas atuam como fitoestrogênios e antioxidantes.
Foi demonstrado apresentar atividade antibacteriana.
Teaflavina monogalato
Polifenol de catequina pertencente à classe dos
flavonoides.
Encontrado em extratos de chá preto, possui atividade quimiopreventiva antitumoral.
Ursololactona
Pertence à classe de triterpenóides. São moléculas
de terpenos contendo seis unidades de isopreno.
Atuação industrial como surfactante e emulsificante.
Fisetina Polifenol vegetal da classe dos
flavonoides.
É um flavonoide natural terapeuticamente ativo, utilizado
na síntese de agentes anti- inflamatórios, anticonvulsivantes
e antiproliferativos.
Gossipetina Hexahidroxiflavona da classe
dos flavonoides.
Isolada a partir de espécies vegetais, exibe forte atividade antibacteriana e radioprotetora. Ácido nordi- hidroguaiarético Pertence à classe de compostos orgânicos conhecidos como dibenzilbutano lignanos.
Atua como agente antineoplásico pela sua capacidade antiproliferativa.
Catacina
Mistura de polímeros de proantocianidinas, uma classe
de polifenóis encontrados em plantas.
Possui atividade anti-hipóxica.
Ácido ursólico Triterpenoide pentacíclico.
Possui atividades antioxidantes e antitumorais pela regulação
da apoptose em células cancerígenas.
Plumbagina Naftoquinona membro da
família dos fenois.
Atua como agente
antimicrobiano, antineoplásico e adjuvante imunológico.
2,3,4-tri-hidroxi-4'- etoxibenzofenona
Benzofenona hidroxilada da classe das cetonas.
Tem atividade protetora contra radiação UV.
Ácido tetra- hidrogambógico
Composto fenólico natural da
classe dos xantanoides. Atua como supressor tumoral.
Quercetina Flavonoide vegetal do grupo
dos polifenois.
Efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes e antiproliferativos
em células tumorais.
Gossipol Aldeído polifenólico da classe
dos sesquiterpenoides.
Potencial atividade antineoplásica. Inibidor de replicação de DNA e indutor de
apoptose.
Juglona Naftoquinona membro da
cianfamília dos fenois.
Atua como agente antibacteriano e antitumoral. Apresenta funções herbicidas.
Pirogalina
Benzotropolona derivada do pirogalol e catecol, da classe das teaflavinas (catequinas).
Encontrado em extratos de chá preto, possui potencial atividade
quimiopreventiva antitumoral.
3,4-didesmetil-5- desidróxi-3'- etoxiscleroina
Hidroxicetona aromática membro da família das
benzofenonas.
Sem informações na literatura.
Fenetil cafeato (CAFE)
Composto fenólico natural, ester de alquil.
Desempenha um papel como agente antineoplásico, anti- inflamatório, imunomodulador,
antioxidante, neuroprotetor, antiviral e antibacteriano.
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Figura 26: Representação das estruturas dos hits obtidos pelo HTS discriminados por características comuns: taninos (a); polifenóis heterotetracíclicos (b); antracenos (c);
a b c d
e
f
g h i
salicilanilidas (d); detergentes (e); flavonoides (f); ácidos aromáticos (ou derivados) (g); xantanas (h); naftoquinonas (i); benzofenonas (j) e triterpenoides pentacíclicos (l).