Avaliação dos fatores significativos da primeira dimensão

A primeira aplicação do DoE foi para a coluna trocadora catiônica. Planejou- se um teste rápido, simples e eficiente para a verificação dos possíveis fatores e intervalos dos parâmetros instrumentais da coluna SCX, que poderiam representar significância na resposta. Portanto, utilizou-se a detecção por espectrofotometria UV-Vis, de modo a verificar a maior recuperação de amostra por meio da obtenção de um pico cromatográfico para cada plugue de sal injetado ou limpeza da coluna.

O teste foi realizado da seguinte maneira: primeiro a coluna SCX foi condicionada com uma solução tampão, assim como o trap. A coluna hidrofóbica foi condicionada com uma solução de 100% de ACN e 0,1% FA (portanto é de se esperar que não ocorra retenção e os analitos serão eluídos em uma única etapa para cada fração da coluna SCX). Em seguida, injetou-se os analitos para a coluna SCX, os peptídeos neutros foram eluídos diretamente para o trap. Retirou-se a coluna SCX do caminho do fluido, por meio do giro da válvula de comutação,

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permitindo a dessalinização dos analitos retidos no trap. Desta forma, promoveu-se a eluição com 100% de ACN e 0,1% FA. Como resultado, obteve-se um pico por meio da detecção por espectrofotometria UV-Vis no comprimento de onda de 214 nm (região de absorbância das ligações duplas dos peptídeos). Em seguida, a coluna SCX foi novamente direcionada no caminho do fluxo da solução tampão e injetou-se um plugue de solução salina (200 mmol L-1 _{de NaCl) para a eluição dos}

peptídeos com cargas líquidas positivas, ou seja, retidos por interação eletrostática na coluna SCX. Novamente, retirou-se a coluna SCX do caminho do fluido o que permitiu a dessalinização dos analitos contidos no trap. Em seguida, realizou-se a eluição com 100% de ACN e 0,1% FA. O processo foi repetido para as seguintes concentrações de solução salina: 500, 1000, 2000, 3000, 4000 mmol L-1. De modo a garantir que todos os peptídeos fossem retirados da coluna SCX, realizou-se a eluição por meio da condição isocrática de uma solução de 3,5 M de NaCl com a bomba Loading Pump (etapa de Limpeza). Para cada plugue de sal foi necessário o tempo de 15 minutos de análise, desta forma para cada ensaio do DoE foram necessário 2 horas e 30 minutos aproximadamente. 49,56 É conveniente mencionar que os valores dos plugues de solução salina não foram avaliados no DoE, e portanto estes foram fixados de modo a tornar o tempo de análise adequado a disponibilidade do equipamento UHPLC.

A Tabela 4 mostra os fatores e intervalo dos valores avaliados (da primeira dimensão cromatográfica). Utilizou-se do planejamento fatorial fracionário 25-1 _com

total de 16 experimentos e duplicata de quatro ensaios experimentais, escolhido de forma aleatória, estes se encontram englobados como a média aritmética na Tabela 4. Os valores de todos os fatores e intervalos dos DoE iniciais, foram obtidos por meio: A) da investigação da literatura especializada4,23,24 _{e B) de alguns testes}

preliminares. A resposta (área) trata-se da soma dos oito picos referentes a cada fração separada na coluna SCX pelos plugues de solução salina, uma vez que não houve separação na segunda dimensão cromatográfica (coluna hidrofóbica). Portanto, é conclusivo mencionar que quanto maior a área maior será a recuperações de amostra, uma vez que a grandeza do sinal analítico (absorbância) esta correlacionado com a quantidade de peptídeos.

61 Tabela 4. Dados do experimento (DoE 1 referente a primeira dimensão)

-1 1

Fatores: 1 Concentração do Tampão (mmol L-1) 5 15

2 % ACN no Tampão 5 15 3 pH 2,5 3,0 4 Vazão (L min-1) 50,00 100,00 5 Concentração de amostra (mg mL-1) 0,63 1,00 Ensaio 1 2 3 4 _1×2×3×4 5 = _{(214 nm)} Área 1 -1 -1 -1 -1 1 64,80 2 1 -1 -1 -1 -1 139,57 3 -1 1 -1 -1 -1 379,49 4 1 1 -1 -1 1 296,04 5 -1 -1 1 -1 -1 97,33 6 1 -1 1 -1 1 120,95 7 -1 1 1 -1 1 229,69 8 1 1 1 -1 -1 319,82 9 -1 -1 -1 1 -1 107,49 10 1 -1 -1 1 1 190,20 11 -1 1 -1 1 1 323,90 12 1 1 -1 1 -1 258,45 13 -1 -1 1 1 1 161,98 14 1 -1 1 1 -1 186,35 15 -1 1 1 1 -1 285,66 16 1 1 1 1 1 259,82 Contrastes: C1 C2 C3 C4 C5 C12 C13 3,46 141,20 -21,67 27,41 -19,37 -35,00 24,17 C14 C15 C23 C24 C25 C34 C35 -4,74 8,25 -24,90 -41,33 -8,27 4,53 5,99 C45 38,64

Os resultados mostram, com 95% de confiança, que dos cinco fatores avaliados, somente a percentagem de acetonitrila no tampão de carregamento (15%) é o fator significativo nos valores ótimos da resposta, conforme pode-se verificar na Figura 22 pelo Gráfico de Pareto e com a Superfície de Resposta, ambos obtidos pelo Software Statistica 10.63

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A Superfície de Resposta com os dois fatores de maior relevância, indicam a previsão de maiores absorbância dos peptídeos de BSA, para este conjunto de experimentos. Verificou-se que os cálculos de até 3 interações gerou confusão entre os contrastes, este fato ocorre quando as interações não possuem significância ou quando o planejamento fatorial fracionário não gera resposta suficiente ao modelo. Portanto, torna-se mais apropriado realizar os cálculos com até 2 interações de modo a eliminar os efeitos que geram confusão.

Figura 22. Gráfico de Pareto e Superfície de Resposta da absorbância de peptídeos

por espectrofotometria UV-Vis em 214 nm.

Diante destes resultados, planejaram-se as condições instrumentais e analíticas da primeira dimensão. Desta forma, para a verificação dos parâmetros significativos da segunda dimensão fixou-se as condições da primeira dimensão tais como: solução tampão fosfato com 15% ACN, devido a melhor resposta do DoE; concentração do tampão de 15 mmol L-1, por permitir boa capacidade tamponante; pH igual a 3,00 devido a maior adequabilidade entre a carga líquida dos peptídeos com a fase estacionária trocadora catiônica, uma vez que o pH de 2,5 gerou maiores tempos de retenção e desta forma a força iônica dos plugues de solução salina podem não ser suficientes para a eluição dos peptídeos. Estas observações, foram

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semelhantes às reportadas por PALMA et al.;24 _{vazão de 125 L min}-1_{,de modo a}

permitir tempos de equilíbrio rápido, assim como a análise e diminuição do efeito de dispersão; concentração de 1 mg mL-1 _{de peptídeos de BSA, de modo a garantir boa}

detectabilidade.

Outra maneira de avaliar os fatores significativos é por meio do gráfico normal dos contrastes. Conforme se pode verificar na Figura 23, somente o fator 2 é realmente significativo, devido este não possuir a mesma tendência no gráfico em relação aos demais fatores (conforme indicado). É possível observar também, que as melhores respostas indicam para o aumento de ACN no tampão, uma vez que o ponto esta no quadrante de valores positivos. Desta forma, estes dados mostram-se condizentes com o Gráfico de Pareto.

Figura 23. Gráfico normal dos contrastes (DoE 1 referente a primeira dimensão).

-2,2 -1,7 -1,2 -0,7 -0,2 0,3 0,8 1,3 1,8 -160,00 -120,00 -80,00 -40,00 0,00 40,00 80,00 120,00 160,00

z

A Figura 24 mostra os cromatogramas da melhor resposta conforme as condições testadas do ensaio número 11 da Tabela 4. Os cromatogramas foram reconstruídos pelo Sofware Origin 8.64

64 Figura 24. Cromatogramas da melhor resposta referente ao DoE 1 e Ensaio 11. As

condições cromatográficas adotadas foram: volume de injeção 5 L, concentração de amostra 1,00 mg mL-1 _{e volume dos plugues de solução}

salina de 125 L. As condições da coluna analítica foram: vazão de 10 L min-1, e temperatura do forno de 35 °C. As condições de eluição foram: gradiente isocrático de 99% de ACN durante 4 min. A detecção foi realizada em 214 nm. O tempo total do experimento foi de 2 horas e 30 minutos.