Avaliação farmacológica

• Isolamento de polimorfonucleados (PMNs)

Polimorfonucleares, predominantemente neutrófilos (80-90 %) foram obtidos de sangue humano cedido pelo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Ceará – HEMOCE (buffy coat) e isolados de acordo com o método descrito por Henson (1971) e modificado por Lucisano & Mantovani (1984). O sangue foi centrifugado, o plasma desprezado e o soro lavado diversas vezes com soluções salina, utilizando solução de gelatina 2,5% (p/v) para formar um gradiente de separação dos componentes sanguíneos.

a. Testes de citotoxicidade

Os ensaios in vitro podem ser empregados na avaliação da segurança de várias substâncias químicas e, para realizá-los, necessita-se apenas de uma pequena quantidade de substãncia. Existem vários parâmetros para a avaliação de citotoxicidade que avaliam desde a medida da integridade da membrana celular (ex.: lactato desidrogenase) até a atividade metabólica da célula (teste do MTT). A avaliação da toxicidade do extrato seco de A.

cearensis e da afrormosina foi realizada com o intuito de avaliar a segurança da CESAC e da

AFM.

•••• Exclusão por Azul de Tripan

A viabilidade celular foi determinada através do ensaio de exclusão por Azul de Tripan (Renzi et al., 1993), onde neutrófilos (2,5 x 106 células/mL) foram incubados por 15 minutos a 37°C na presença de CESAC (5, 10, 50, 100 e 200 µg/mL), AFM (5, 10, 25, 50 e 100 µg/mL), DMSO (controle – CESAC: 0,4; AFM: 1%), Hanks (células não tratadas) ou Triton X-100 (controle positivo – 0,2%).

A seguir, os tubos de reação foram centrifugados a 755 x g, por 10 minutos a 4°C. Os sobrenadantes foram descartados e os sedimentos de células foram suspensos em 200 µ L de solução de Hanks contendo 0,1% de gelatina. Uma alíquota dessa suspensão foi misturada com igual volume de Azul de Tripan, preparado a 0,1% em NaCl 0,15M e transferida para a câmara de Neubauer. Este corante é incorporado apenas por células não viáveis, devido a lesões na membrana plasmática. A proporção de células viáveis foi estimada pela contagem de 200 células em microscópio óptico.

•••• Atividade da enzima Lactato desidrogenase (LDH)

Neutrófilos (2,5 x 106 células/mL) foram incubados por 15 minutos a 37°C na presença de CESAC (5, 10, 50, 100 e 200 µg/mL), AFM (5, 10, 25, 50 e 100 µg/mL), DMSO (controle – CESAC: 0,4; AFM: 1%), Hanks (células não tratadas) ou Triton X-100 (0,2% - controle positivo).

A seguir, os tubos de reação foram centrifugados a 755 x g, por 10 minutos a 4°C. Os sobrenadantes foram transferidos para outros tubos e mantidos em banho de gelo para a determinação da atividade da enzima LDH, cuja localização está no citoplasma da célula e é liberada quando estas são lesadas ou necrosadas. Esta enzima é responsável pela conversão de

piruvato a lactato na presença de NADH. O ensaio é realizado utilizando o Kit LDH (Liquiform) e baseia-se na medida do decréscimo da absorvância em 340nm devido à oxidação do NADH, a qual é proporcional à atividade da LDH na amostra. Alíquotas de 250 µ L de substrato foram pré-incubados por 3 minutos a 37°C. Adicionou-se 25 µ L da amostra de sobrenadante, homogeneizou-se a mistura e realizou-se a leitura da absorvância em 340 nm nos tempos 1 e 3 minutos a 37°C em espectrofotômetro. A atividade da enzima LDH foi calculada seguindo-se as especificações do fabricante da seguinte maneira:

A= [(A1-A2)/2] x 1746,03

Onde:

A= atividade da enzima LDH na amostra em U/L; A1= absorvância inicial (1 minuto) em 340 nm;

A2= absorvância final (3 minutos) em 340 nm;

1746,03= fator de cálculo estipulado pelo fabricante para volume de amostra de 25 µ L.

A toxicidade de CESAC e de AFM foi avaliada em três experimentos independentes, com medidas em triplicata.

•••• Teste do MTT

É um método colorimétrico para determinar a viabilidade celular e se baseia no fato do MTT, sal de coloração amarela, ser reduzido pelo sistema enzimático succinato- tetrazol redutase que forma parte da cadeia respiratória da mitocôndria, a um sal, Formazan, que possui cor púrpura. Assim a ausência da redução do MTT indica uma diminuição da atividade metabólica celular, ou seja, na viabilidade celular (Mosmann, 1983).

Neutrófilos (2,5 x 106 células/mL) foram incubados por 30 minutos a 37°C na presença de CESAC (5, 10, 50, 100 e 200 µg/mL), AFM (5, 10, 25, 50 e 100 µg/mL), DMSO (controle – CESAC: 0,4; AFM: 1%), Hanks (células não tratadas) ou Triton X-100 (0,2% - controle positivo) em placa de 96 poços e atmosfera de CO2. Decorrido esse período, a placa foi centrifugada a 2000rpm por 15 minutos a 25°C e o sobrenadante descartado e incubada uma nova solução (200 µ L) contendo 10% de MTT, na concentração de 10 mg/mL, e estas células foram incubadas novamente por mais 3 horas. Por fim, a placa foi centrifugada

novamente nas mesmas condições acima, o sobrenadante foi descartado e adicionado então 150 µL de DMSO puro para a lise das células e solubilização do formazan. Neste instante, as placas foram agitadas durante 15 minutos com o auxílio de um agitador de placas. A absorvância foi medida em leitor de microplacas a 540 nm. Os experimentos foram realizados em quintuplicata e repetidos em três dias diferentes.

•••• Teste de Laranja de acridina/Brometo de Etídio

O Teste de Laranja de acridina/Brometo de etídio é utilizado para avaliação da viabilidade celular através da mensuração do índice de apoptose celular. Esta técnica descrita por McGahon et al. (1995) emprega, em uma dada população celular, uma coloração diferencial com laranja de acridina e brometo de etídio para a identificação de quatro categorias celulares determinadas em função de sua morfologia e coloração: células viáveis, apoptóticas iniciais, apoptóticas finais e necróticas.

O laranja de acridina e o brometo de etídio poder ser utilizados na identificação das células em apoptose, tanto no estágio inicial quanto no estágio tardio. O laranja de acridina se intercala no DNA, proporcionando uma coloração verde. Este corante também se liga ao RNA, mas como não se intercala, o RNA é corado em vermelho-alaranjado. Assim, uma célula viável apresenta um núcleo esverdeado e um citoplasma vermelho. O brometo de etídio penetra somente em células mortas. Este corante também se intercala no DNA, conferindo uma aparência laranja ao núcleo, mas se liga fracamente ao RNA, o qual pode aparecer ligeiramente vermelho. Assim, células vivas com membrana intacta têm uma coloração verde uniforme em seu núcleo. Células em apoptose inicial com membrana intacta, mas com fragmentação de DNA, possuem uma coloração verde em seu núcleo e citoplasma, sendo visível uma marginação de seu conteúdo celular. Células em apoptose final apresentam áreas coradas em laranja tanto no citoplasma como nos locais onde a cromatina está condensada no núcleo, o que as distinguem de células necróticas, que têm uma coloração alaranjada uniforme no núcleo.

As lâminas foram preparadas utilizando-se 25 µL de suspensão de neutrófilos (2,5 x 106 células/mL), pré-incubadas a 37°C por 15 minutos com CESAC (10, 100 e 200 µg/mL), AFM (10, 50 e 100 µg/mL), DMSO (controle – CESAC: 0,4; AFM: 1%), Hanks (células não tratadas) e Triton X-100 (controle positivo – 0,2%), e 1µ L de corante (100 µg/mL de laranja de acridina e 100 µg/mL de brometo de etídio) em uma lâmina limpa e seca coberta com

lamínula. Foram analisadas 200 células por repetição com microscópio Nikon em objetiva de 60X com filtros para fluorescência (515 – 560 nm).

Para a quantificação percentual de cada evento celular (viáveis, necróticas e apoptóticas), foram contadas 300 células de cada amostra.

b. Avaliação da atividade antiinflamatória em modelos experimentais in vivo •••• Edema de pata induzido por carragenina em camundongos

Descrito por Winter et al. (1962) o edema inflamatório induzido pela injeção de subcutânea de carragenina na pata é resultante da ação seqüenciada e integrada de vários mediadores inflamatórios que causam aumento agudo e progressivo do volume da pata. Assim, esse modelo tem sido considerado útil para avaliação da atividade antiinflamatória de novos compostos.

Camundongos Swiss, machos (25 a 30g) divididos em grupos de 6 animais foram tratados com CESAC (100, 200 e 400 mg/Kg, v.o.), indometacina (5 mg/Kg, i.p.) Tween 80 (controle - 0,4% em água destilada, v.o.) 60 minutos antes da injeção intraplantar de 100 µ L da solução de carragenina a 1% na pata traseira, direita do animal. O volume da pata foi medido antes (tempo zero) e 1, 2,3 e 4 horas após a injeção de carragenina, através de pletismômetro (Ugo Basile, Itália). O volume de edema foi determinado em µ L pela diferença entre o volume da pata nos referidos intervalos de tempo e o volume antes da injeção de carragenina.

• Peritonite induzida por carragenina em camundongos

O ensaio foi desenvolvido segundo protocolo experimental proposto por Ferrándiz & Alcaraz (1991). Grupos de 8 animais foram tratados com CESAC (100, 200 e 400 mg/Kg, v.o.), dexametasona (5 mg/Kg, v.o.) ou Tween 80 (controle - 0,4% em água destilada, v.o.). Decorridos 60 minutos, os animais receberam uma injeção de carragenina (10 mL/Kg, i.p.). A seguir os animais foram devolvidos às caixas e deixados com livre acesso à ração e água durante 5 horas. O exsudato peritoneal foi coletado com uma pipeta Pasteur plástica através de laparoscopia abdominal. Para coleta todos os animais receberam uma injeção de PBS (Tampão Fosfato de Sódio) heparinizado (5 UI/mL). Uma amostra do lavado peritoneal foi

diluída1: 20 em líquido de Turk para contagem de leucócitos totais. Os resultados foram expressos em número de células/mL.

Também foram analisados no exsudato peritoneal os seguintes parâmetros antioxidantes: os níveis de glutationa reduzida (GSH) (ELLMAN, 1959), os níveis de nitrito/nitrato (CHEN et al., 2000) e dosagens de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (HUONG et al., 1998).

c. Avaliação antiinflamatória em modelo experimental ex vivo: Lavado bronco-alveolar em ratos desafiados com antígeno.

• Metodologia de sensibilização dos animais

A sensibilização ao antígeno (ovalbulmina) foi realizada ativamente através da administração, por via intraperitoneal, de solução contendo 1µg/mL de ovalbulmina (OVA) e 1mg/mL de Al (OH)3, em solução salina (NaCl 0,9%) sendo injetados 0,66 mL por animal. Este procedimento ocorreu no “dia zero”, e a partir de 13 a 14 dias após esse procedimento, este grupo de animais foi definido como sensibilizados.

• Metodologia do desafio antigênico

São considerados animais desafiados os ratos previamente sensibilizados que foram submetidos ao desafio antigênico por inalação. O desafio ocorreu 1 hora após o primeiro tratamento com CESAC (100, 200 e 400 mg/Kg, v.o.), DEXA (5 mg/kg) ou Tween 80 (controle - 0,4% em água destilada, v.o.). Para tanto, os animais foram colocados em uma caixa acrílica medindo 20 x 30 x 21 cm, que continha dois orifícios para a circulação de ar, onde em um dos quais era acoplado um nebulizador ultrassônico e expostos a nebulização com OVA durante 30 minutos, o qual estava dividido em duas sessões sequenciais de 15 minutos, onde na primeira sessão foi utilizada OVA na concentração de 1mg/mL e na segunda, OVA na concentração de 5 mg/mL. As alterações respiratórias observadas nos animais foram o desconforto respiratório caracterizado por “sibilos” e aumento do ritmo respiratório. Após esse procedimento, os animais foram definidos como desafiados.

• Efeito de CESAC no lavado bronco-alveolar de ratos desafiados com antígeno

Para avaliação do efeito de CESAC no conteúdo do lavado bronco-alveolar de ratos, os animais foram divididos nos seguintes grupos: aqueles considerados “normais”, ou

seja, não receberam nenhum tratamento sensibilizante e aqueles sensibilizados e desafiados que foram tratados com CESAC (100, 200 e 400 mg/Kg, v.o.), DEXA (5 mg/kg) ou Tween 80 (controle - 0,4% em água destilada, v.o.). Os animais foram inicialmente anestesiados com hidrato de cloral a 40% (1 mL/Kg) em altas doses. Após exposição cirúrgica e canulação da traquéia, os animais foram exsanguinados pela artéria carótida e os pulmões foram preenchidos com 5 mL de solução salina a 37°C, injetada na cânula traqueal por meio de uma seringa de 20 mL, de acordo com Hutson (1989). A seringa foi mantida conectada à cânula traqueal por três minutos e, então, o fluido injetado foi lentamente recuperado. Este procedimento foi repetido duas vezes. Os fluidos recuperados foram misturados e acondionados em tubos de ensaio e divididos em duas partes: uma amostra do lavado peritoneal foi diluída1: 20 em líquido de Turk para contagem de leucócitos totais. Os resultados foram expressos em número de células/mL. A outra parte foi utilizada para determinação dos seguintes parâmetros antioxidantes: os níveis de glutationa reduzida (GSH), os níveis de nitrito e dosagens de substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS).

d. Efeito do CESAC e da AFM sobre a desgranulação de neutrófilos ativados por fMLP ou PMA mensurada pela inibição da enzima mieloperoxidase Desgranulação dos neutrófilos. A suspensão de neutrófilos (2,5 x 106 células/mL) foi pré-incubada com CESAC (5, 10, 25, 50, 100 e 200 µ g/mL), AFM (0,1; 3; 6; 12,5; 25; 50 e 100 µg/mL), indometacina (100 µ M), DMSO (controle – CESAC: 0,4; AFM: 1%) ou solução de Hanks (células não tratadas). A seguir foi adicionado citocalasina B (10 µM) e fMLP (100 nM), por 10 minutos a 37°C ou PMA (0,1 µM) por 15 minutos a 37°C. Decorridos esse tempo, o material foi centrifugado durante 10 minutos a 4°C e o sobrenadante obtido, rico em enzimas liberadas pela desgranulação leucocitária, foi utilizado nos ensaios enzimáticos realizados segundo metodologia descrita por Úbeda e colaboradores (2002).

Determinação da concentração de MPO. Aos 50 µL do sobrenadante foi adicionado PBS (100 µ L), tampão fosfato (50 µ L) e H2O2 (0,012%). Após 5 minutos a 37°C foi acrescido 20 µ L de 3,3’,3,5’-tetrametilbenzidina (TMB 1,5 mM) e a reação foi interrompida pela adição de 30 µ L de acetato de sódio (1,5 M; pH 3,0). A absorbância foi determinada em 620 nm. A construção de uma curva padrão pela adição de quantidades crescentes de MPO (0,125 – 3 U/mL) permitiu relacionar a absorvância com as unidades enzimáticas/mL. Os resultados foram expressos como percentual como percentual de inibição da desgranulação neutrofílica (De Young et al., 1989).

• Efeito do CESAC e da AFM sobre a atividade da enzima mieloperoxidase No intuito de avaliar o efeito de CESAC ou AFM sobre a atividade da enzima mieloperoxidase, o método descrito acima foi utilizado, mas desta vez, neutrófilos humanos foram primeiramente estimulados com PMA (0,1 µM) e então alíquotas do sobrenadante foram incubadas com CESAC (5, 10, 25, 50, 100 e 200 µg/mL) ou AFM (3; 6; 12,5; 25; 50 e 100 µg/mL) por 15 minutos , seguido da determinação da atividade de MPO como descrito acima (Andrews & Krinsky, 1981).

• Efeito do CESAC e da AFM sobre a atividade da enzima elastase

Na tentativa de esclarecer o mecanismo de ação de CESAC e AFM, foi avaliado o efeitos de ambos sobre a atividade catalítica da enzima elastase, utilizando a técnica descrita por Johansson et al. (2002) e modificada por Kanashiro et al. (2007). Para o isolamneto da enzima elastase, em um tubo, incubaram-se 4,5 mL de neutrófilos (2,5 x 106 células/mL) com 250 µ L de citocalasina B (1µM) a 37°C por 10 minutos. Em seguida, a desgranulação foi ativada pela adição de 250 µ L de fMLP (1 µM). Simultaneamente, fez-se o tubo controle negativo (branco), contendo apenas neutrófilos e solução de Hanks. Após a incubação por 30 minutos a 37°C, os tubos de reação foram centrifugados a 755 x g por 10 minutos. O sedimento, contendo células, foi desprezado e o sobrenadante, rico em elastase, foi utilizado no ensaio para determinar a atividade desta enzima.

Em microplaca, 200 µ L de sobrenadante foram colocados na presença de CESAC (6,25; 12,5; 25; 50 e 100 µg/mL), AFM (5, 10, 25, 50 e 100 µg/mL), DMSO (controle – CESAC: 0,4; AFM: 1%) ou Hanks (células não tratadas). Como controle negativo utilizou-se o sobrenadante dos neutrófilos não estimulados. Finalmente o substrato SAAVNA (1mM) foi adicionado e, imediatamente, realizada a leitura da absorvância (tempo zero) em leitor de microplacas, em comprimento de onda de 405 nm. A placa foi mantida a 37°C por 20 minutos e, em seguida, realizada outra a 405 nm para quantificar a produção de p-nitroanilina durante este período. Os valores de absorvância obtidos nos ensaios foram tratados da seguinte forma:

Abs= Abs (20) – Abs (0)

Onde:

Abs (20) – absorvância em 405 nm no tempo 20;

Abs (0) – absorvância em 405 nm no tempo 0 (esta leitura é feita imediatamente após a adição do substrato).

Os valores de Abs obtidos nos poços-teste de cada experimento foram comparados com os valores de DMSO para verificar se CESAC ou AFM possuem atividade modulatória sobre a atividade da enzima elastase.

• Efeito de CESAC e AFM sobre os níveis de TNFα

A suspensão de neutrófilos (2,5 x 106 céls/ml) foi pré-incubada durante 15 min a 37°C com CESAC (5, 10, 50, 100 e 200 µg/mL) ou AFM (5,10, 25, 50 e 100 µg/mL), DMSO (controle – CESAC: 0,4; AFM: 1%) ou solução de Hanks (células não tratadas). Alíquotas da suspensão (500µ L) foram incubadas em banho-maria (37ºC) durante 15 minutos na presença de PMA (0,1µM). Decorridos esse tempo, o material foi centrifugado durante 10 minutos a 4°C e o sobrenadante obtido, rico em enzimas liberadas pela desgranulação leucocitária, foi utilizado no ensaio para determinação dos níveis de TNFα. O teor de TNF-α liberado foi determinado pela técnica de ELISA, de acordo com as orientações descritas pelo fabricante (Bioscience, USA).

e. Avaliação do Efeito Antioxidante in vitro • Ensaio de Quimioluminescência

A quimioluminescência (QL) é amplamente utilizada como um método para quantificar a capacidade dos neutrófilos de produzir EROs (Kudoh et al., 1999). Com o auxílio de marcadores luminescentes (sondas) é possível quantificá-las e diferenciá-las. As sondas são utilizadas para aumentar a quantidade de luz emitida durante a produção de EROs. Estas sondas são substâncias orgânicas que servem de substrato para reações redox, que geram intermediários eletronicamente excitados que, retornando a um estágio basal emitem fótons, os quais podem ser quantificados como quimioluminescência. As sondas utilizadas foram: a lucigenina (QLluc), que detecta principalmente o radical ânion superóxido (O2-), liberado no meio extracelular, e o luminol (QLlum) que detecta a somatória de diversos metabólitos intracelulares produzidos pela ação da MPO.

Neutrófilos (2,5 x 106 células/mL) foram pré-incubados em banho-maria a 37°C por 2 minutos na presença de ESPC ou AFM em diferentes concentrações e das sondas quimioluminescentes luminol (280 µM) ou lucigenina (150 µM). Em seguida, os tubos foram transportados para o luminômetro e a eles adicionados o estímulo (PMA 10 -7 M) e, imediatamente, acompanhou-se a produção de QL, em cpm (contagem de fótons por minuto), durante 20 minutos a 37°C. Como controle do solvente utilizou-se DMSO nas concentrações finais de 0,4% ou 1%. Em todos os ensaios realizados mediu-se a produção espontânea de QLlum e QLluc dos neutrófilos na ausência de estímulo. Os resultados foram expressos através da inibição da produção de quimioluminescência.

• Teste do DPPH

O radical DPPH (1,1-difenil-2-picril hidrazina) é considerado um radical estável e tem sua absorção máxima em 517 nm. Este radical é utilizado como ferramenta para estudar a ação de compostos como seqüestradores de radicais livres, sendo uma técnica independente de qualquer atividade enzimática. Quando o DPPH um elétron ou um átomo de hidrogênio para se tornar um composto mais estável, sua absorção diminui.

O método descrito por Saint-Cricq et al. (1999) utiliza uma alíquota (0,1 mL) de CESAC (10, 50 e 100 µg/mL) ou AFM (10, 50 e 100 µg/mL) que foi misturada com 3,9 mL de DPPH (0,3 mM numa solução de metanol-etanol 1:1). A seguir as soluções foram misturadas com auxílio de vortex por 1 minuto, mantidas em uma temperatura ambiente por 30 minutos e a absorbância foi determinada em 517 nm.

O percentual de inibição foi calculado de acordo com a seguinte equação: % inibição= [A0 – (Ac/A0)] x 100

Onde:

A0= absorvância do controle (sem ESPC ou AFM)