Avaliação do efeito do derivado 3-fenilcumarínico C13 no metabolismo oxidativo de neutrófilos humanos estimulados via receptores Fcγ e/ou CR, utilizando diferentes tipos

de IC precipitados formados de: IgG-OVA, IgG-OVA/SHN e F(ab’)2-OVA/SHN, e

também o estímulo solúvel PMA.

Em trabalhos anteriores do grupo de pesquisa, o derivado 3-fenilcumarínico (C13) inibiu o metabolismo oxidativo de neutrófilos de coelhos estimulados com imunocomplexos (IC) de forma mais eficiente do que o flavonoide Quercetina. Essa substância também foi capaz de interagir de maneira similar à Quercetina com o sítio ativo da enzima HRP (horseradish

peroxidase) por meio de análises de Modelagem Molecular através de docking (Kabeya, et.

al., 2008). Recentemente, foi demonstrado que a C13 é capaz de inibir a enzima mieloperoxidase humana, através de ensaios biológicos com a enzima isolada (Andrade, et. al., 2013). Dessa forma, dando continuidade ao entendimento do efeito biológico do derivado 3-fenilcumarínico sobre o metabolismo oxidativo de neutrófilos, foram realizados ensaios de quimioluminescência (QL) utilizando as sondas luminol (QLlum) e lucigenina (QLluc) de neutrófilos humanos estimulados com diferentes tipos de IC e estímulo solúvel (PMA). Nos ensaios de QLlum, na ausência de tratamento das células com o derivado 3-fenilcumarínico, foi obtido um padrão de resposta que pode ser visto no Apêndice 1.

Em todos os ensaios aqui realizados, as concentrações empregadas da C13 não apresentaram efeito tóxico para as células (Andrade et al., 2013). A C13 apresentou efeito inibitório da quimiluminescência, produzida pelos neutrófilos humanos quando ativados via diferentes estímulos. As figuras 4.1, 4.2, 4.3 e 4.4 mostram perfis de QLlum e QLluc, referente a um experimento para os diferentes estímulos. Avaliou-se o efeito da C13 em diferentes concentrações no intuito de verificar se o efeito inibitório na QLlum e na QLluc é dependente de concentração. Nas figuras 4.1, 4.2, 4.3 e 4.4 pode-se verificar os valores de área integrada referente à QLlum e QLluc de todos os experimentos realizados em diferentes concentrações do derivado 3-fenilcumarínico, com os diferentes estímulos, mostrando que a C13 apresentou um efeito inibitório da QL dependente da concentração, como pode ser visto também pelos valores de porcentagem de inibição nas figura 4.1, 4.2, 4.3 e 4.4.

Figura 4.1: Quimioluminescência dependente de luminol (QLlum) e de lucigenina (QLluc) de neutrófilos humanos estimulados via FcγR por meio de IC precipitado formado de IgG-OVA:

Neutrófilos (1x106 _{ml) foram tratados (3 min, 37°C) com C13 (0,02 – 20 µmol/L), DMSO (0,1% -}

controle solvente) ou HBSS suplementado com 0,1% de gelatina e em seguida estimulados com IC precipitado formado de IgG-OVA (60µg/ml), medindo-se a QL (15 min, 37°C) em luminômetro. a) Perfis cinéticos representativos de QLlum e QLluc com medidas da produção de fótons por minuto; b) Área integrada de QLlum e QLluc; c) Porcentagem de Inibição de QLlum e QLluc calculada em relação ao DMSO 0,1% (controle solvente). As células incubadas com HBSS não foram estimuladas.

Abreviaturas: E: espontâneo; QLlum: quimioluminescência dependente de luminol; QLluc:

quimioluminescência dependente de lucigenina.

Figura 4.2: Quimioluminescência dependente de luminol (QLlum) e de lucigenina (QLluc) de neutrófilos humanos estimulados via FcγR e CR3 por meio de IC precipitado formado de IgG- OVA opsonizado com SHN: Neutrófilos (1x106 _{ml) foram tratados (3 min, 37°C) com C13 (0,02 – 20}

µmol/L), DMSO (0,1% - controle solvente) ou HBSS suplementado com 0,1% de gelatina. As células foram estimuladas com IC precipitado formado de IgG-OVA/SHN (60µg/ml), medindo-se a QL (15 min, 37°C) em luminômetro de placa. a) Perfis cinéticos representativos de QLlum e QLluc com medidas da produção de fótons por minuto; b) Área integrada de QLlum e QLluc; c) Porcentagem de Inibição de QLlum e QLluc calculada em relação ao DMSO 0,1% (controle solvente). As células incubadas com HBSS não foram estimuladas. Abreviaturas: E: espontâneo; QLlum: quimioluminescência dependente de luminol; QLluc: quimioluminescência dependente de lucigenina.

SHN: soro humano normal.

Figura 4.3: Quimioluminescência dependente de luminol (QLlum) e de lucigenina (QLluc) de neutrófilos humanos estimulados via CR3 por meio de IC precipitado formado de F(ab’)2-OVA

opsonizado com SHN: Neutrófilos (1x106 _{ml) foram tratados (3 min, 37°C) com C13 (0,02 – 20}

µmol/L), DMSO (0,1% - controle solvente) ou HBSS suplementado com 0,1% de gelatina. As células foram estimuladas com IC precipitado formado de F(ab’)2-OVA/SHN (60µg/ml), medindo-se a QL (15

min, 37°C) em luminômetro. a) Perfis cinéticos representativos de QLlum e QLluc com medidas da produção de fótons por minuto; b) Área integrada de QLlum e QLluc; c) Porcentagem de Inibição de QLlum e QLluc calculada em relação ao DMSO 0,1% (controle solvente). As células incubadas com HBSS não foram estimuladas. Abreviaturas: E: espontâneo; QLlum: quimioluminescência dependente de luminol; QLluc: quimioluminescência dependente de lucigenina. SHN: soro humano normal.

Figura 4.4: Quimioluminescência dependente de luminol (QLlum) e de lucigenina (QLluc) de neutrófilos humanos estimulados com PMA: Neutrófilos (1x106 _{ml) foram tratados (3 min, 37°C)}

com C13 (0,02 – 20 µmol/L), DMSO (0,1% - controle solvente) ou HBSS suplementado com 0,1% de gelatina. As células foram estimuladas com PMA (10-7 _{mol/L), medindo-se a QL (15 min, 37°C) em}

luminômetro. a) Perfis cinéticos representativos de QLlum e QLluc com medidas da produção de fótons por minuto; b) Área integrada de QLlum e QLluc; c) Porcentagem de Inibição de QLlum e QLluc calculada em relação ao DMSO 0,1% (controle solvente). As células incubadas com HBSS não foram estimuladas. Abreviaturas: E: espontâneo; QLlum: quimioluminescência dependente de luminol; QLluc: quimioluminescência dependente de lucigenina.

A análise do efeito inibitório da C13, em diferentes concentrações, possibilitou calcular o CI50, isto é, a concentração do derivado 3-fenilcumarínico necessária para inibir 50% da

QLlum ou QLluc. A porcentagem de inibição da QLlum pelo derivado 3-fenilcumarínico C13 obedeceu a seguinte ordem, de acordo com o tipo de estímulo: 0,80 ± 0,21 (PMA) < 1,05 ± 0,16 (IgG-OVA) < 1,40 ± 0,09 [F(ab’)2-OVA/SHN] < 2,06 ± 0,23 (IgG-OVA/SHN). Já para a

QLluc, o padrão de inibição foi: 1,28 ± 0,05 (IgG-OVA) < 1,84 ± 0,29 (PMA) < 2,22 ± 0,2 (IgG-OVA/SHN) < 3,01 ± 0,36 [F(ab’)2-OVA/SHN]. Os valores de CI50 e a análise estatística

para esse ensaio podem ser vistos na Tabela 4.1. O efeito inibitório da C13 na QLlum foi significantemente maior do que na QLluc.

Tabela 4.1: Inibição da QLlum e da QLluc pelo derivado 3-fenilcumarínico C13, representado pelo valor de CI50 (µmol/L), para neutrófilos humanos estimulados com

diferentes tipos de imunocomplexos precipitados e também com o estímulo solúvel PMA.

(a) Resultados expressos como média ± desvio padrão de três experimentos, com medidas em duplicata. Análise estatística: valores com letras diferentes representam diferença estatística (p<0,05; ANOVA seguido pelo teste de Tukey). Abreviaturas: QLlum: quimioluminescência dependente de luminol; QLluc: quimioluminescência dependente de lucigenina.

4.2. Análise da interação do derivado 3-fenilcumarínico C13 com o sítio ativo da enzima