Avaliação Histológica do efeito citotóxico de NE contendo Paclitaxel e

Havendo demonstrado que a combinação de paclitaxel e ceramida na nanoemulsão reduz de forma mais pronunciada a viabilidade celular comparado aos compostos ativos individuais, avaliamos o efeito citotóxico em modelos tridimensionais de melanoma, gerados em equivalentes cutâneos. Como controle, foram utilizando equivalentes de pele saudáveis (sem melanoma). Cortes histológicos foram observados em diferentes magnificações em microscópio ótico a fim de visualizar alterações nos tecidos decorrentes do tratamento.

Na figura 28 estão representados cortes histológicos de tecidos saudáveis após 21 dias de diferenciação, utilizado como controle para o tecido com melanoma. Na figura 28 A, que representa tecido não tratado, é possível observar as camadas derme e epiderme. A epiderme apresenta estratificação e organização adequadas, com a presença de núcleos celulares típicos da camada basal (epiderme) e a diferenciação dos queratinócitos. Na derme podemos observar fibroblastos e a presença de fibras de colágeno.

A aplicação da NE vazia (sem fármacos, figura 28 B) por 48 h promoveu alteração na espessura da epiderme e aumento da desorganização dessa camada, resultado já esperado, baseado no fato de que a formulação contém promotores de absorção e tensoativos, conhecidos pela capacidade de desorganizar o estrato córneo. Ainda, esse resultado também é compatível com o aumento da perda de água transepidérmica mediada pela nanoemulsão. Notamos ainda a presença de células na camada basal da epiderme e que a estrutura da derme foi mantida. O tratamento com a nanoemulsão contendo ceramida e paclitaxel (figura 28 C) resultou em um efeito bem mais pronunciado, sendo observada morte celular mais acentuada na epiderme, e alterações maiores quanto à espessura e organização dessa camada.

Figura 28- Microscopia óptica mostrando um modelo de pele (3D) reconstituído. (A) Não Tratado, (B) tratamento com NE vazia (30μL) e (C) com NE + Paclitaxel + Ceramda C6 (30 μL). O tratamento foi feito durante 48 hs e as peles mantidas em atmosfera a 37 ºC e CO2 5%. Coloração HE; barras = 50 μm; 20 X e 40 X de ampliação.

Havendo observado a citotoxicidade da formulação contendo a combinação de fármacos em tecidos saudáveis, avaliamos sua citotoxicidade em tecidos com melanoma, ou seja, modelo de pele obtido mediante o cultivo de células de melanoma SKMEL 19 com os componentes da epiderme, a fim de avaliar o efeito da formulação sobre a proliferação e invasão dessas células.

A avaliação histológica dos tecidos mostrou que a presença das células de melanoma prejudicou a diferenciação do tecido, resultando em múltiplos focos tumorais (Figura 29 A). Há redução no número de camadas da epiderme, não sendo possível distinguir a camada basais, estrato espinhoso e granuloso. Ainda é possível notar que há maior quantidade de células na epiderme, característico da diferenciação celular acelerada observada em tumores. Na Figura 29 B, é possível observar infiltração das células de melanoma na derme de tecidos não tratados, com presença de ilhas de invasão, focos de maior celularidade, em regiões próximas à epiderme. Isso reflete a invasão de células tumorais na derme através da camada basal, que é degradada por células de melanoma, e através dela invadem a derme, formando os focos de invasão (Santos et al., 2011).

Tal como observado na Figura 29 C, o tratamento do modelo de pele com melanoma com NE vazia mostrou que a NE por si só é capaz de promover a desorganização da epiderme (como observado também em tecidos saudáveis, na figura 28 B) e promover morte celular, embora ainda seja possível visualizar células viáveis na pele, principalmente na camada basal da epiderme.

No entanto, quando o tecido foi tratado com NE contendo paclitaxel e ceramida C6 (Figura 29 D), observamos grande destruiçõa do tecido. As poucas células remanescentes apresentaram coloração castanha escura dos núcleos, o que é representativo de células apoptóticas, mostrando que a formulação promove morte das células tumorais da epiderme e derme, eliminando a invasão. Porém, resultante do efeito citotóxico da formulação, notamos que houve também a morte das células saudáveis que compõe a epiderme e derme, além de eliminação do estrato córneo. Esse efeito dá suporte à importância de localizar os compostos na pele a fim de reduzir os efeitos adversos resultantes de sua exposição sistêmica.

Figura 29- Microscopia óptica mostrando um modelo de pele (3D) reconstituído com melanoma humano linhagem SK MEL 19. (A) Não Tratado, (B) Não Tratado, (C) tratamento com NE vazia (30 μL) e (D) com NE + Paclitaxel + Ceramda C6 (30 μL). O tratamento foi feito durante 48 hs e as peles mantidas em atmosfera a 37º C e CO2 5%. Coloração HE; barras = 50 μm; 20 X de ampliação.

6 DISCUSSÃO

Diferentes tipos de microemulsões com estruturas internas variáveis podem ser obtidas dependendo dos tipos e razão entre os componentes utilizados (Kreilgaard, 2002). Um dos principais fatores que controla a emulsificação é a estrutura e concentração de tensoativos e consequentemente a tensão interfacial do sistema. A razão entre tensoativos é um fator fundamental para a formação de sistemas emulsionados e sua capacidade de incorporação de água (Bouchemal et al., 2004). Sabe-se também que a composição e proporção dos componentes da fase oleosa também influencia o processo de emulsificação. Sendo assim, diferentes diagramas de fase foram obtidos para avaliar a relação entre composição e fase formada.

Foram observadas diferenças quanto à capacidade de solubilização de água e consequentemente, áreas de formação de microemulsões, em função da proporção entre os componentes da mistura de tensoativos e da fase oleosa. O aumento na proporção de propilenoglicol (Figura 7 B, Tabela 3) promoveu uma redução na área de formação de microemulsão, e muito embora estudos anteriores demonstrem que a presença de propilenoglicol na mistura de tensoativos auxilia a incorporação de água por microemulsões (Hosmer et al., 2009), nossos resultados sugerem a possibilidade de existência de uma quantidade ótima deste co-tensoativo, acima da qual ocorre redução da área de formação de microemulsões. O aumento na proporção de vitamina E TPGS ou BRIJ não alterou de forma muito marcante a área de formação das microemulsões (Figura 7 C e D, Tabela 3). Por isso, optamos pelo uso de tensoativos na proporção de 1:1:1:1 (Brij: vitE: PG: etanol, m/m/m/m).

Com relação à influência da fase oleosa sobre a área de formação da microemulsões observamos que utilizando somente tributirina como fase oleosa, a área de existência microemulsão foi de apenas 29% (Figura 8 A, tabela 3). Essa área aumentou ao acrescentar monocaprilina à fase oleosa, sendo maximizada quando da utilização de monocaprilina:tributirina na proporção de 6:1 (Figura 8 D). Esses resultados são consistentes com estudos prévios que demonstram que a utilização de triglicerídeos (ex: tributirina) na fase oleosa diminui a incorporação de água nas formulações comparado a monoglicerídeos (como a monocaprilina) (Lopes et al., 2010). Também entram em acordo com outros estudos demonstrando que o uso de monoglicerídeos de cadeia mais curta, com pequeno volume molecular ou alta polaridade, permite maior incorporação de água na formulação, ou seja, a área

de microemulsão no diagrama de fase diminui à medida que o comprimento de cadeia do monoglicerídeo aumenta (Pepe et al., 2012).

Enquanto a monocaprilina é um conhecido promotor de absorção cutânea e sua maior concentração pode promover uma penetração dos fármacos mais eficiente (Hosmer et al., 2013; Lopes, 2009; Pepe et al., 2012) a maximização da concentração de tributirina pode auxiliar na eficácia da formulação (Heidor et al., 2012). Por esses motivos, selecionamos 2 microemulsões para avaliar a influência da fase oleosa sobre a penetração cutânea: ME 4-1 (monocaprilina: tributirina 4:1, m/m) e ME 2-1 (monocaprilina: tributirina 2:1, m/m). Essas formulações foram preparadas com a mesma quantidade de água (40%) e com as mesmas proporções entre tensoativos:fase oleosa (6:4, m/m), tendo como diferencial apenas a fase oleosa, uma contendo maior quantidade de monocaprilina (ME 4-1) do que a outra (ME 2-1). Juntamente com a nanoemulsão, essas microemulsões foram submetidas à caracterização mais detalhada.

Ao avaliarmos as características das formulações, observamos que todas as formulações apresentaram diâmetro na faixa nanométrica, potencial zeta levemente negativo e comportamento reológico do tipo newtoniano. Estudos anteriores sugeriram que propriedades reológicas de nanocarreadores dispersos como as micro e nanoemulsões são afetadas pelo tamanho das partículas e proporção de fase dispersora, sendo partículas de tamanhos maiores e em maior quantidade resultam em viscosidades mais altas em decorrência da diminuição da camada aquosa entre as gotículas, o que favorece as interações (atração/repulsão) e o atrito entre as mesmas (Mason, et al., 1996; Mason,1999). Também podemos observar que a nanoemulsão é um fluido menos viscoso comparado às microemulsões, o que pode influenciar a espalhabilidade da formulação na superfície cutânea e melhorar a disponibilidade dos fármacos mediante aumento de sua difusão e liberação (Cross et al., 2001; De Mattos et al., 2015; Jumaa et al., 1999; Rassu et al., 2015).

Os valores negativos de potencial zeta encontrados para as formulações pode estar relacionado à presença dos tensoativos Tween e Brij. Embora considerado não iônicos, eles frequentemente promovem potencial zeta levemente negativo em decorrência da dissociação ou solubilização de suas moléculas, que existiam previamente como pares iônicos neutros, e por isso tendem a reduzir o valor absoluto do potencial zeta (Kong, Park, 2001; Legrand et al., 1999). Outros estudos que relacionaram o uso de tensoativos não-iônicos e o potencial zeta de sistemas

dispersos, como o de Vleeschauwer (1999) e colaboradores, mostram que a adição de tensoativos não- iônicos ocasiona a queda no valor absoluto do potencial zeta das gotículas de emulsões.

Sabe-se que o potencial zeta está relacionado com a estabilidade física da formulação e morfologia da superfície das partículas, ou seja, se a carga da superfície for relativamente alta, os glóbulos vizinhos vão se repelir e tendem a se manter separados. Sendo assim, glóbulos altamente carregados tendem a permanecer em dispersão. Caso contrário, esses glóbulos podem se aglomerar e alterar as características físicas do sistema (Delgado et al., 2007). Um potencial zeta mínimo menor do que -30 mV ou superior a +30 mV é geralmente associado à uma boa estabilidade física da dispersão por períodos de tempo prolongados (Capek, 2004). Entretanto o estudo de Kong, Park (2011) também indica que esse valor é baseado em teorias experimentais e não deve ser usado como a única forma de prever a estabilidade do sistema. O estudo de Rohrer (2015) e colaboradores por exemplo, mostra que em um sistema emulsionado com potencial zeta variando entre −0.8 ± 0.9 mV e −7.1 ± 0.2 mV manteve-se estável após estresse gravitacional. O estudo de Han (2008) e colaboradores também demonstra que formulações dispersas com potencial zeta de -16,0 mV, apresentaram estabilidade durante mais de 1 ano, o que foi atribuído provavelmente ao efeito da estabilização estérica resultante do tensoativo não- iônico utilizado, e que por sinal, é o mesmo utilizado no desenvolvimento da nanoemulsão (Tween) e do poloxamer, o polímero adicionado a formulação que atua como co-tensoativo para facilitar o a emulsificação, reduzir o tamanho das partículas e aumentar a estabilidade da formulação devido, provavelmente, à redução da energia livre interfacial do sistema, e mediante um efeito estabilizador do polímero ao redor das gotículas (Derakhshandeh et al., 2010; Tan et al., 2009).

O valor do pH também foi avaliado e os valores encontrados (5-6) estão dentro da faixa desejada para formulações destinadas à aplicação cutânea, uma vez que o pH da pele encontra-se normalmente ao redor de 5,5 (Nogueira, Correia, 1995).

Para averiguar possíveis alterações nas formulações em função do tempo foi realizado o teste de estresse gravitacional. Este é considerado um teste preliminar de estabilidade. A centrifugação gera um estresse na formulação que permite antecipar possíveis alterações de estabilidade, podendo ser observadas através de

alterações no tamanho e carga das gotículas, separação de fases e pH da formulação (Nogueira, Correia, 1995). A centrifugação não alterou de maneira pronunciada o tamanho das gotículas, índice de polidispersidade, potencial zeta e pH. A ausência de alterações no potencial zeta após a centrifugação das formulações pode estar associada à ausência de mudanças nos valores de pH, uma vez que estudos anteriores sugerem que o potencial zeta é dependente de pH, e através de modificações no pH pode-se controlar a carga de partículas dispersas (Liu et al., 2006). A incorporação dos fármacos também não afetou de maneira pronunciada esses parâmetros, mostrando que as características da formulação permaneceram constantes após a incorporação dos fármacos.

Para investigar se as formulações têm capacidade de alterar a função barreira da pele, desorganizando o estrato córneo e aumentando a permeabilidade dos fármacos, o efeito das formulações sobre a perda de água transepidérmica foi avaliado (Figura 16). Todas as formulações aumentaram a perda de água transepidérmica, o que está de acordo com observações anteriores relacionadas com a capacidade de formulações tópicas nanodispersas contendo monocaprilina ou ácido oleico de perturbar a função barreira da pele (Hosmer et al., 2012; Leonardi, 2004; Lopes, et al., 2015). Outros componentes das formulações, como os tensoativos também podem ter influenciado esses resultados. Em comparação com o controle, o efeito da formulação ME 4-1 foi mais pronunciado, sugerindo que possivelmente maiores quantidades de monocaprilina atuem de forma mais pronunciada desorganizando o estrato córneo. Entretanto, comparando as formulações entre si, não observamos diferença significativa.

Tendo sido observado que as formulações possuem a capacidade de modular o estrato córneo e promover penetração cutânea, avaliamos a penetração dos compostos ativos e os quantificamos nas camadas da pele e fase receptora. Dessa forma, pudemos avaliar a eficácia das formulações em promover a penetração especificamente do paclitaxel e ceramida C6 (figuras 19 e 20 respectivamente).

Observa-se, em relação ao controle, que todas as formulações proporcionaram um aumento na penetração e retenção do paclitaxel no estrato córneo e na fração epiderme + derme após as 8 h do experimento. Estes resultados estão de acordo com estudos anteriores que descrevem micro e nanoemulsões como sistemas de liberação tópica mais eficientes comparado a formulações convencionais (Constantinides et al., 2008; Lawerence; Rees, 2000).

As duas microemulsões desenvolvidas apresentaram habilidade semelhante em aumentar a penetração de paclitaxel e ceramida C6 na pele. Estudos anteriores mostraram que uma diferença de 10% de monocaprilina entre formulações foi suficiente para promover maior penetração cutânea (Lopes, Murphy, 2009). Em nossos experimentos tivemos uma diferença de aproximadamente 4% desse monoglicerídeo entre as microemulsões, mas essa diferença não modulou a penetração cutânea do fármaco. A nanoemulsão foi a formulação de maior eficácia na promoção da penetração dos fármacos na pele, promovendo a penetração de quantidades de paclitaxel e ceramida 2,24 – 2,44 e 1,63-1,71 superior, respectivamente, às microemulsões, enquanto promovendo menor permeação transepidérmica (112 vezes inferior à sua localização na pele para o paclitaxel, enquanto a permeação da ceramida ficou abaixo do limite de quantificação do método analítico).

Esses resultados foram fundamentais na escolha da formulação NE para darmos continuidade aos nossos experimentos. A diferença na penetração dos fármacos pode estar relacionada à composição das formulações: NE contém ácido oleico como promotor de permeação cutânea e tween como tensoativo, enquanto as microemulsões contém monocaprilina e uma mistura de tensoativos e co-tensoativos que inclui BRIJ e etanol (Leonardi, 2004; Lopes et al., 2015). Uma possibilidade é que o ácido oleico seja mais eficiente para promover desorganização do estrato córneo e aumentar a permeabilidade dessa camada. No entanto, essa suposição não encontra suporte em nossos resultados, pois não houve diferença significativa entre NE e as microemulsões com relação à perda de água transepidérmica.

Diferenças na composição podem influenciar o tamanho das gotículas e a viscosidade do sistema. Estudos anteriores sugerem que a morfologia dos agregados é importante para a sua interação com o estrato córneo, e que o tamanho reduzido da fase interna dos nanocarreadores favorece a penetração (Yuan et al., 2010). Geralmente, tem sido aceito que a redução do tamanho das partículas de macro para a ordem nano aumenta a penetração (Lopes, 2014; Yuan et al., 2010). Como exemplo, temos que o transporte de diazepam aumentou quando da diminuição do tamanho das gotículas de emulsões para abaixo de 1 micrômetro (100-300 nm) (McCarley et al., 2001). Friedman (1995) e colaboradores mostraram também que houve melhoria significativa na liberação transdérmica de valerato e dipropionato de betametasona, indometacina, diclofenaco, piroxicam e naproxeno

usando formulações com partículas de óleo de cerca de 100 nm em comparação com emulsões convencionais. Mais recentemente, Sahle (2013) e colaboradores, observaram que ceramidas penetram em camadas mais profundas e em maior quantidade através de microemulsões com gotículas menores. As gotículas da nanoemulsão estudada aqui apresentaram diâmetro aproximadamente 10-14 nm inferior ao das microemulsões. Entretanto, em decorrência da existência de poucas evidências em relação à influência do tamanho da fase interna comparando sistemas dentro da gama nanométrica, não julgamos possível tecer conclusões sobre a influência da diferença de diâmetro das formulações estudadas.

A viscosidade da formulação é relevante para a liberação dos fármacos, e influencia a disponibilidade deles para entrar na pele (Cross et al., 2001; De Mattos et al., 2015; Jumaa et al., 1999; Rassu et al., 2015). Tsai (1999) e colaboradores mostraram que a penetração in vitro do alcaloide berberina através da pele de ratos foi inversamente relacionada à viscosidade da pomada aplicada, e Potter (1999) e colaboradores mostraram que a absorção de benzo(a)pireno a partir de óleos de aplicação tópica foi reduzida com o aumento da viscosidade do óleo. Como vimos nas figuras 10 e 11, a nanoemulsão possui viscosidade cerca de 3,8 vezes inferior às microemulsões, fator que pode ajudar a justificar a maior eficácia da NE em promover a penetração cutânea dos fármacos.

Por fim, é importante levar em consideração o teor de água das formulações. O teor aquoso da nanoemulsão é maior (66%) comparado à microemulsão (40%). Além de influenciar a viscosidade, a literatura nos traz informações de que a água é considerada um intensificador de permeação, e este efeito pode contribuir para as propriedades de aumento de penetração de formulação (Williams et al., 2004). Alterações no teor de água de uma formulação é uma abordagem de longa data para alterar a penetração: Walkley, (1972) já estudava os efeitos da água sobre a penetração cutânea na década de 70. A imersão da pele em água, expondo a membrana à humidade elevada, pode promover o intumescimento dos corneócitos e promover aumentos na penetração de fármacos (Walkley, 1972; Williams et al., 2004).

De maior relevância é o fato que o aumento de água em formulações também poder aumentar a atividade termodinâmica e difusão do fármaco na formulação (Zhang, Michniak-Kohn, 2011). Podlogar e colaboradores (2005) mostraram que a taxa de liberação do fármaco aumentou com o teor de água e atribuiu o fenômeno a

um aumento da difusão do cetoprofeno dentro das formulações com maior quantidade de água. Sintov e Shapiro (2004) relataram o aumento da permeação junto com o aumento do teor de água em sistemas emulsionados. Os autores observaram que o com o aumento de água na formulação, o fluxo de lidocaína aumentou de 12,5 ± 4,31 (12% água) para 45,78 ± 5,15 (20% água) e finalmente para 61,60 ± 9.99 μg/cm. Outros estudos mostram que a permeação de fármacos lipofílicos aumenta com o teor de água de uma forma exponencial enquanto que para fármacos hidrofílicos, a permeação parece aumentar linearmente (Walkley, 1972; Zhang, Michniak-Kohn, 2011).

A atividade termodinâmica do fármaco representa sua tendência em sair do veículo, ou seja, a força motriz para que o fármaco seja liberado do veículo e penetre na pele (Aulton, 2005; Barry, 1985; Hadrgraft, 2001; Kuswahyuning et al., 2014). Supõe-se que aumento na atividade leva a aumento da velocidade de permeação do fármaco através da pele. A atividade termodinâmica depende da solubilidade do fármaco no veículo (que pode ser modulada através de alteração do pH e composição da formulação) e é máxima quando a solução está saturada

(Asmussen, 1991; Hadgraft, 1999; Michaels et al., 1975). Dessa forma, podemos sugerir que o aumento da quantidade de água incorporada na nanoemulsão comparado às microemulsões pode estar aumentando a atividade termodinâmica do paclitaxel e ceramida C6, e assim favorecendo a liberação dos compostos ativos para a pele e sua penetração (Kuswahyuning et al., 2014; Nishihata et al., 1988; Ostrenga et al., 1971). Essa afirmação encontra suporte no trabalho de Barry (1985)

e colaboradores que mostrou que a liberação de álcool benzílico na pele era diretamente proporcional à sua atividade termodinâmica.

Após a escolha da formulação por sua maior capacidade em promover a penetração cutânea, e visando observar a co-localização dos fármacos com a NE, utilizamos a técnica de microscopia de fluorescência, em que observamos claramente as diferenças de penetração cutânea dos fármacos através das camadas da pele. Através das imagens, é possível observar maior penetração tanto do paclitaxel como da ceramida C6 em relação aos controles. Este experimento comprova a capacidade da NE de promover a retenção cutânea dos fármacos paclitaxel e de ceramida C6, bem como sua co-localização principalmente na epiderme, o que é desejável considerando que é nesta camada que a maioria dos tumores cutâneos se desenvolve. O padrão sinuoso dos feixes (figura 21 F), sugere

que a ceramida tenha se acumulado nas fibras de colágeno presentes na derme, ou seja, na matriz extracelular, o que pode ser devido a sua afinidade pelas membranas celulares (Cha et al., 2016; Kendall et al., 2015). Estudos em linhagem celular de fibroblastos tem demonstrado que a ceramida C6 exógena acumula-se no complexo de Golgi sendo usada pelas células em vias de biossíntese dos esfingolipídeos, e há evidencias de que induz a formação de vesículas endocíticas e aumento dos endossomos tardios nessas células (Li et al., 1999; Lipsky, Pagano 1983; Martin et al., 1993).

O interesse em formulações tópicas que visam aumentar a localização do paclitaxel na pele tem crescido ao longo dos últimos anos; sendo assim, na primeira parte deste estudo, diferentes tipos de nanocarreadores foram desenvolvidos, caracterizados e investigados quanto a sua capacidade de promover a penetração cutânea de paclitaxel e ceramida C6. Visando então obter maiores informações