Avaliação dos níveis hormonais de insulina, Glucagon e Corticosterona no soro de animais tratados com lipopolissacarídeo (LPS).

O tratamento com LPS (1 mg/Kg) promoveu um aumento significativo na concentração sérica de TNFα nos animais Swiss e nos Wild Types (C3H/HeN) tratados com LPS: Swiss (LPS) 639 ± 118 pg/mL versus 7,51 ± 1,8 pg/mL (animais Controle). Os animais Wild Type C3H/HeJ tratados com LPS apresentam 523,9 ± 11,2 pg/ml versus 45,49±5,1 do grupo Controle; os animais C3H/HeJ (camundongos com receptor TLR4 mutante) não apresentaram diferença significativa entre os grupos. Também foram observados aumentos séricos na concentração dos hormônios insulina e glucagon após o tratamento com LPS (1 mg/Kg) nos animais Swiss grupo LPS 376,7 ± 82,9 (pM) versus 150,3 ± 7,3 (pM) grupo controle. A concentração sérica de Glucagon nos animais Swiss também apresentou aumento significativo no grupo LPS 47,5 ± 13,2 (pM) e 16,02 ±5.1 (pM) no grupo CONTROLE como mostrado na tabela a baixo.

Tabela 1: Concentração sérica das citocinas (TNFα e IL1β) e hormônios (Insulina e

Glucagon) de camundongos Swiss; C3H/HeJ e C3H/HeJ tratados LPS 1 mg/Kg ou salina. Os valores representam média ± EPM. * p<0,05 grupos LPS vs controle (n: 4), TNF-α, Insulina e Glucagon.

8. DISCUSSÃO

Atualmente, os processos inflamatórios sistêmicos têm recebido grande atenção em estudos que procuram compreender a sua relação com a obesidade, diabetes e a sinalização intracelular (VELLOSO et al., 2009; GREGOR & HOTAMISLIGIL, 2011).

A AMPK hipotalâmica é uma proteína com importante participação na resposta contrarregulatória por ser ativada em condições de baixa disponibilidade de energia e ser capaz de modular o metabolismo celular através da inibição de vias anabólicas e ativação de vias catabólicas. Sua ativação em neurônios do núcleo arqueado do hipotálamo cursa com o aumento da expressão de neuropeptídeos orexígenos, menor gasto energético e a produção de glicose hepática (HAN, 2005; NAMKOONG, 2005; SEO et al., 2008).

Desde o início da década de 80 os estudos em modelos de sepse tem procurado desvendar os mecanismos bioquímicos envolvidos com nesta doença visando entender o que leva a os distúrbios da homeostase glicêmica (HOLMAN & SABA, 1988, GUILLEM et al, 1982; ARDAWI et al, 1989). Estes estudos mostraram que durante a evolução da sepse a capacidade do fígado de sintetizar glicose é significantemente reduzida. Em estudos mais recentes, este evento foi associado à ação das citocinas pró-inflamatórias e endotoxinas que modulam a ativação e expressão de fatores de transcrição tais como STAT3, FOXO1 e PGC1 (YERKOVICH et al., 2004; CHICHELNITSKIY et al., 2009; RAMADOSS, 2009; PHILLIPS, 2010; MIAO et al., 2012). Durante a evolução do quadro de endotoxemia ou sepse ocorre o aumento do consumo de glicose por tecidos ricos em macrófagos, tais como fígado e baço, e o aumento da produção de citocinas pró-inflamatórias tais como TNFα, interleucina 6 (IL6) e IL1-β, principalmente através do receptor TLR4 pelo seu ligante o LPS (MIZOCK, 1995; MIZOCK 2001; KAWAI & AKIRA, 2006; OSTUNI & ZANONI, GRANUCCI, 2010; TWEEDELL et al. 2011). Inicialmente um quadro de hiperglicemia pode ser observado e este ser seguido por hipoglicemia decorrente da inibição da PEPCK hepática nas primeiras 4 horas após o tratamento (MCCALLUM, 1981; KUTTNER et al., 1986; MAITRA et al., 1999; GILL & STERLING, 2001). Entretanto, o aumento na demanda por glicose não traria danos para a homeostase se a glicemia fosse corrigida pela maior ativação e utilização de substratos neoglicogênicos pelo fígado.

Embora os estudos que investiguem a relação entre as citocinas inflamatórias e os danos na sinalização de hormônios no hipotálamo sejam extensos, o efeito destas citocinas sobre a proteína AMPK hipotalâmica ainda é pouco conhecido. Além disso, também não existem estudos na literatura que tenham explorado a relação entre a ativação de TLR4 por LPS e seu efeito sobre a AMPK hipotalâmica e a produção de glicose hepática.

Considerando a importância da proteína AMPK hipotalâmica na modulação da resposta contrarregulatória e produção hepática de glicose durante a hipoglicemia e o jejum, nossa hipótese foi de que a ação das citocinas inflamatórias e a ativação da via do receptor TLR4 poderia desempenhar importante papel na modulação da homeostase da glicose. O tratamento com LPS promoveu redução da glicemia de jejum nas diferentes doses empregadas, mas apenas na dose de 1 mg/Kg seu efeito foi significativo, ocorrendo também diminuição da ingestão alimentar e aumento significativo da concentração sérica das citocinas. Nestes animais a proteína AMPK hipotalâmica também apresentou menor fosforilação, assim como a proteína ACC, uma proteína alvo da AMPK, sugerindo menor atividade desta quinase. É importante salientar que este efeito no hipotálamo foi observado em jejum, uma já descrita condição relacionada com a ativação da AMPK hipotalâmica, provavelmente pela redução da disponibilidade da glicose (HAN, 2005; NAMKOONG, 2005; MINOKOSHI et al., 2004, PASCOE & SMYTHE, STORLIEN, 1989; ROPELLE et al., 2007). Além disso, também observamos o aumento da fosforilação da proteína STAT3 hipotalâmica que tem papel importante na desfosforilação da AMPK promovida pela leptina. A proteína STAT3 pode ser ativada pela leptina através da fosforilação pela JAK2 ou ser ativada por TNF-α e IL6, desencadeando os efeitos clássicos atribuídos à ação central destas citocinas, tais como redução da fome, aumento da temperatura corpórea e aumento do gasto energético (RIZK, 2001; BORGES, 2011). Neste sentido, Borges e colaboradores demonstraram que os efeitos centrais das citocinas inflamatórias e da leptina têm proteínas em comum, tais como a AMPK e STAT3 (YAMAWAKI et al., 2010; BORGES, 2011). Desta maneira, embora a glicemia tenha sido reduzida pelo tratamento com LPS, é provável que a ação central de citocinas pró-inflamatórias impeça a fosforilação e ativação da AMPK. Este efeito também foi acompanhado por significativa redução na ingestão noturna de ração e na área sob a curva durante o teste de tolerância a glicose se comparado ao grupo controle.

Estes resultados nos mostram que o tratamento com LPS está promovendo intensa modulação dos parâmetros fisiológicos relacionados à homeostase da glicose.

Embora a resposta contrarregulatória seja exercida por diferentes mecanismos hormonais e bioquímicos, importantes alterações tais como, a diminuição da área sob a curva no desafio ao piruvato e a redução da glicemia mostram que há redução na capacidade hepática de produzir glicose em animais que receberam o LPS. Os estudos iniciais que demonstraram os danos na neoglicogênese pelo tratamento com LPS (MAITRA et al.,1999; GILL & STERLING, 2001) foram recentemente corroborados e demonstraram que a expressão de proteínas neoglicogênicas é modulada pela proteína STAT-3, JNK e FOXO1 no fígado (INOUE, 2004; ; RAMADOSS, 2009; PHILLIPS, 2010). É conhecido que a proteína FOXO1 possui íntima relação com a transcrição de proteínas neoglicogênicas (PHILLIPS, 2010), quando fosforilada a FOXO1 está inativa saindo do núcleo para o citoplasma, nesta situação ocorre à inibição da transcrição de proteínas neoglicogênicas tais como a PEPCK e G6Pase, a inibição dessas proteínas também é modulada pela ação das proteínas STAT3 e JNK (INOUE, 2004; RAMADOSS, 2009; JIAO; FENG; XU, 2012).

A JNK é uma serina quinase que participa da via de sinalização do TNFα e está intimamente ligada aos processos inflamatórios da sepse. O TNFα é produzido através da ativação do NFKB que também é ativado pela via de sinalização do TLR4. Alem do TNFα, o NFKB na participa da via do TLR4 transcrevendo citocinas pró-inflamatórias, como o IL6, que tem a STAT3 como uma proteína chave na sua via de sinalização. A STAT3 como classicamente descrita na literatura participa da via da leptina, TNFα e IL6 sendo ativa por fosforilação e promovendo a inibição da transcrição de proteínas neoglicogênicas (RIZK, 2001), evento que também é observado pela ação da serina quinase JNK (YERKOVICH et al., 2004; YANG et al., 2010). A JNK e STAT3 são importantes proteínas que modulam negativamente a transcrição das proteínas neoglicogênicas (PEPCK e G6Pase (PHILLIPS, 2010; YANG et al., 2010).

Neste sentido, os resultados obtidos até o momento nos mostram que as proteínas STAT-3 e FOXO1 no fígado encontram-se mais fosforiladas, sugerindo maior atividade da STAT-3 e inibição da FOXO1, foi também verificado aumento na fosforilação da JNK hepática e aumento nos níveis de insulina com tratamento de LPS (como mostrado na tabela nos resultados). É conhecido que a ação da insulina no sistema nervoso central é capaz de

reduzir a síntese de glicose de maneira dependente da STAT-3 (INOUE et al., 2006). Esse dados são corroborados pela diminuição da quantidade de G6Pase e PEPCK no fígado, diminuição de mRNA da PEPCK (mRNA do G6Pase não apresentou diferença significativa) e também pela diminuição da produção de glicose (avaliada pelo PTT), sugerindo que o prejuízo na produção de glicose possa ter sido ocasionado tanto pelo processo inflamatório induzido pela ativação do TLR4, citocinas inflamatórias (TNF-α, IL6 e IL1β) (INOUE et al., 2006; RAMADOSS et al., 2009; PHILLIPS, 2010; YANG et al., 2010). Contudo não podemos descartar que a insulina neste momento também esteja agindo diretamente no fígado e no hipotálamo levando a redução na produção de glicose pelo fígado (INOUE et al., 2006).

Como é conhecido e também foi descrito acima, a AMPK hipotalâmica é uma importante proteína responsável pela ativação da resposta contrarregulatória em períodos de jejum, glicemia baixa e déficit de energia, estimulando a secreção de hormônios catabólicos (HAN et al., 2005; FAN et al., 2009). Como a AMPK hipotalâmica tem papel fundamental no controle dos mecanismos que reestabelecem a glicemia basal, avaliamos o efeito da ativação farmacológica da AMPK hipotalâmica através da administração de AICAR 2 mmol por via intracerebroventricular para avaliar a ação da ativação da AMPK frente a sepse. Interessantemente, observamos que os animais que receberam previamente AICAR intracerebroventricular e posteriormente foram tratados com LPS, não apresentaram aumento na glicemia se comparado ao grupo que recebeu somente LPS, indicando o restabelecimento na glicemia. Han e colaboradores (2005) demonstraram que a ativação farmacológica da AMPK hipotalâmica com AICAR exerce uma importante função no restabelecimento da glicemia, como observado em animais induzidos à hipoglicemia através da administração de insulina, sendo também observada, uma maior secreção de catecolaminas, corticosterona e glucagon (HAN et al., 2005).

Após verificarmos o aumento na glicemia pelo tratamento prévio com AICAR investigamos ativação/fosforilação da AMPK hipotalâmica. O tratamento prévio com AICAR impediu a redução da fosforilação da AMPK hipotalâmica, corroborando o resultado observado de que estes animais apresentam maior glicemia que os animais LPS. Nestes animais também observamos o aumento na quantidade de G6Pase e PEPCK, e aumento na expressão de mRNA de PEPCK se comparado ao grupo que só recebeu LPS. Indicando que

a modulação da AMPK hipotalâmica é essencial para o reestabelecimento da glicemia e produção de glicose hepática (SHIUCHI, 2011).

Após avaliarmos os efeitos positivos da ativação da AMPK hipotalâmica sobre o metabolismo, investigamos o papel do receptor TRL4 frente da atividade da AMPK hipotalâmica e a produção de glicose hepática. Para isso foram utilizados animais com mutação no receptor TLR4 (C3H/HeJ) e seus controles selvagens (C3H/HeN). Observamos que após a administração de LPS (1mg/kg) nos animais selvagens (C3H/HeN – LPS) ocorreu diminuição significativa da glicemia se comparados aos seus respectivos controles (C3H/HeN – salina), também foi observado uma significativa diminuição na fosforilação da AMPK hipotalâmica e diminuição da quantidade de PEPCK no fígado dos animais tratados com LPS. Estes resultados corroboram aos observados nos animais Swiss. Interessantemente os animais mutantes do receptor de TLR4, que foram tratados com LPS, não apresentaram diminuição da glicemia, assim como também não foi observado qualquer efeito sobre a fosforilação da AMPK hipotalâmica e quantidade de PEPCK. Os resultados deste trabalho juntamente com os dados existentes na literatura sugerem que a via do receptor TLR4 possui um importante papel na indução da hipoglicemia, pela inibição da proteína AMPK hipotalâmica e posteriormente, pela inibição das proteínas neoglicogênicas hepáticas. Adicionalmente nossos resultados mostram que a prévia ativação farmacológica da AMPK hipotalâmica nos animais tratados com LPS preveniu parcialmente os eventos ocasionados pela inflamação. Desta maneira, acreditamos que a AMPK hipotalâmica é um alvo importante para os estudos que procuram desenvolver novos fármacos que melhorem a sobrevida de pacientes com sepse.

9. CONCLUSÃO

Este estudo demonstrou os danos a homeostase glicêmica oriundos do quadro de sepse/endotoxemia, onde há inibição de importantes vias que controlam a manutenção da glicemia, como a via da AMPK hipotalâmica e vias que controlam a produção de glicose hepática. Todavia com a ativação farmacológica da AMPK hipotalâmica os danos no restabelecimento da glicemia são minimizados mostrando que a via AMPK hipotalâmica é um importante alvo terapêutico para controle da glicemia na sepse/endotoxemia.

10. REFERENCIAS

1. AGATI, J. M.; YEAGLEY, D.; QUINN, P. G. 1998. Assessment of the role

ofmitogen-activated protein kinase,phosphatidylinositol3Kinase protein kinase B, and protein kinase C in insulin inhibition of cAMP-induced phosphoenolpyruvate carboxykinase gene tran -scription. J. Biol. Chem. N.273.

Vol. 30 p.18751-18759.

2. AKIRA, S. & TAKEDA, K. (2004) Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol 4 499-