Para avaliar a reação inflamatória, optou-se por análises qualitativa e quantitativa. Para tanto, os tecidos obtidos dos animais foram encaminhados para análises mascaradas, independentes, realizadas respectivamente por patologista (análise qualitativa) e morfologista (análise quantitativa). O desconhecimento da droga aplicada no momento da cirurgia conferiu imparcialidade à análise e aos resultados.
Houve preocupação em utilizar-se a melhor técnica para a identificação dos elementos celulares. Sabe-se que a grande maioria das estruturas celulares e teciduais são transparentes, incolores e com índice de refração muito próximo, o que dificulta a observação. Há, portanto, necessidade da utilização de corantes histológicos que evidenciem tais
estruturas. As técnicas procuram associar o caráter básico ou ácido do corante a ser utilizado ao do material a ser evidenciado. Dessa maneira, cria-se o grupamento químico responsável pela cor ou grupamento cromóforo. As moléculas ácidas, como os ácidos nucléicos (DNA e o RNA), por exemplo, são estruturas basófilas. As estruturas ricas em grupamentos básicos, proteínas, por exemplo, são acidófilas, por terem afinidade por corantes ácidos.
A coloração por hematoxilina e eosina é a mais usada na prática médica. A hematoxilina é um corante básico que cora componentes ácidos, como o núcleo, que passa a ser identificado em tom de azul. A eosina é um corante ácido, que cora componentes básicos, como o citoplasma, que passa a ser identificado em intenso tom cor de rosa.
As colorações tricrômicas (Masson) foram concebidas para ser utilizadas principalmente para distinguir o colágeno a partir do tecido muscular. Em geral, essas colorações consistem em corantes nucleares, colágenos e citoplasmáticos em mordentes como, por exemplo, o ácido fosfotúngstico ou ácido fosfomolíbdico. Identificam os núcleos em cor preta ou azul, o citoplasma em cor vermelha, as fibras musculares em cor vermelha e o colágeno em cor azul.
As características químicas das colorações utilizadas possibilitaram analisar as diferentes estruturas e processos celulares. Uma vez feita a opção pelas duas técnicas de coloração, destacaram-se os elementos celulares na primeira e as áreas de reação granulomatóide e as estruturas do colágeno na segunda. Vantagem decorrente disso foi a criação de dois
parâmetros de análise, ou seja, o patologista tinha a oportunidade de examinar o mesmo corte corado com HE e TM e, assim, ratificar ou retificar a classificação do infiltrado inflamatório. Isso permitiu que as amostras coradas por HE e TM fossem avaliadas de forma independente, o que minimizou a subjetividade do patologista, pois as amostras teciduais foram revistas para então proceder-se a classificação do infiltrado inflamatório.
Igual situação ocorreu com as medidas das reações granulomatóides. Essas áreas foram delimitadas, sem interdependência, nas duas condições de coloração e geraram dados distintos, que posteriormente foram submetidos à analise estatística.
A análise qualitativa do infiltrado inflamatório presente nos cortes realizados nas áreas de estudo levou em consideração o tipo de células encontradas e a presença de fibrose. Observando-se o Quadro 3 e as Tabelas 1 e 2, verifica-se maior intensidade inflamatória nos olhos do grupo controle, com predomínio de linhagem celular (neutrófilos e macrófagos) típica dos processos mais intensos. Esse parâmetro de análise mostra que o TRI atuou de forma efetiva na redução da resposta inflamatória, com infiltrado de menor intensidade em todos os olhos submetidos à sua ação.
Tal observação ganha maior importância em decorrência do já citado observador mascarado e reforça o conhecimento farmacocinético de que TRI reduz o número de linfócitos circulantes e no local da aplicação (Derendorf et al., 1995). Ratifica-se a clínica farmacológica que aponta o TRI como o mais potente derivado da triancinolona. Embora a triancinolona por
si só seja de uma a duas vezes mais potente que a prednisona em modelos animais de inflamação, o TRI é aproximadamente oito vezes mais potente que a prednisona (Mosby’s Drug Consult, 2005).
A presença de fibrose foi fato comum e representou aspecto relevante associado à reação granulomatosa. Embora não tenha havido medida direta da fibrose, as observações feitas a partir da coloração TM sugerem sua proporcionalidade à intensidade do processo inflamatório instalado.
A busca por dados concretos correlacionados à resposta tecidual decorrente da agressão cirúrgica suscitou a criação de métodos quantitativos de análise, realizados de forma objetiva e excluindo-se ao máximo a influência imposta pelo examinador.
Minguini et al. (2000) propuseram estimar, de forma semiquantitativa, a área de cada reação granulomatóide verificada ao redor do material de sutura. A ferramenta utilizada foi o uso da fórmula para cálculo da área de uma elipse. Assim, segundo esses autores, seria possível dispor de importante parâmetro. Critica-se, porém, a marcação manual e imprecisa dos locais estipulados como aqueles que delimitaram a forma geométrica escolhida.
Neste trabalho, incorporou-se o princípio proposto por Minguini et al. (2000); contudo, a análise da reação granulomatóide foi quantitativa e feita de modo inédito. O emprego do microscópio Zeiss modelo Axioskop 40, acoplado a computador equipado com programa Axionvision 3.1, para delimitação na ordem de micrômetros quadrados, possibilitou mensurar as áreas da reação granulomatóide e conferiu a possibilidade de obtenção
de medidas objetivas. Este fato é deveras importante, principalmente se lembramos que o micrômetro é a milésima parte (0,001 mm) do milímetro.
Simultaneamente à análise das características histológicas dos tecidos presentes no local da nova inserção muscular, realizou-se avaliação da extensão da reação granulomatóide e conseqüente análise estatística, demonstrando-se, nos olhos tratados com triancinolona, redução significante da área de reação granulomatóide em comparação com os olhos controle.
Mais uma vez a validade do método proposto neste estudo é atestada, pois as diferentes colorações ampliaram o número de amostras e os resultados obtidos mostraram que as medidas das áreas das reações granulomatóides são estatisticamente iguais nos dois tipos de coloração empregados.
A correlação entre o tipo de infiltrado inflamatório e as áreas das reações granulomatóides mostrou-se proporcional, visto que a maior intensidade inflamatória foi verificada nos olhos em que se obtiveram as maiores medidas morfométricas. Esse fato certifica o modo de análise usado, pois mostra por meio de métodos distintos, que os olhos submetidos à aplicação de TRI foram os que apresentaram menor resposta tecidual frente à agressão cirúrgica imposta.
Contudo, ao examinar-se minuciosamente os resultados da morfometria, encontram-se situações de comportamento diferente do que foi descrito até o presente. No Quadro 4, verifica-se que os coelhos de número 5, 11 e 13 tiveram maior área de reação granulomatosa (medida sob HE) nos olhos submetidos ao TRI. Também, no Quadro 5, encontra-se nos coelhos de número 4, 12 e 13 comportamento similar (medida sob TM).
A necessidade de entender o que se passou leva ao exercício da especulação dos motivos causais desses achados. De início, a realização de cortes próximos, mas não coincidentes, pode justificar a diferença da ordem de micrômetros quadrados. Outro possível fato pode ter sido a cauterização, que embora realizada de forma padronizada, poderia causar agressão distinta na área de 1 cm² do leito escleral. Pode-se ainda questionar a resposta individual de cada animal ao fio de sutura, visto que, na análise histológica qualitativa, que retrata mais amplamente a situação, o infiltrado inflamatório dos referidos coelhos foi sempre de maior intensidade nos olhos submetidos a SAL. Por fim, a proximidade presente entre essas medidas não permite conclusão estatisticamente válida.
A confrontação do peso dos coelhos com os resultados obtidos por meio da morfometria foi feita com o objetivo de observar-se a eventual relação entre a intensidade da resposta inflamatória e cicatricial e essa variável. A suposição era de que, quanto mais pesados fossem os animais, maior seria a resposta à agressão cirúrgica imposta a eles. No entanto, embora a análise dos resultados sugira correlação entre essas variáveis (Gráficos 6 e 7), a análise estatística não revelou igualdade significante (Tabela 4).
Saliente-se que as ilações relacionadas aos achados deste estudo aplicam-se, estatisticamente, à amostra de animais provenientes do biotério da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo.
Nas condições de realização do estudo, concluiu-se que:
a) O tipo de infiltrado inflamatório presente nos tecidos analisados, e que retrata a intensidade da inflamação, foi dependente do tipo de substância utilizada (p < 0,001). A porcentagem de infiltrados inflamatórios leves ou moderados foi maior nos coelhos em que se aplicou o acetato de triancinolona (81,25%), enquanto a proporção de infiltrados inflamatórios moderados ou intensos foi maior nos coelhos em que se utilizou a solução salina (87,50%).
b) No grupo submetido à aplicação de solução salina, a área da reação granulomatóide medida quando se utilizou a coloração hematoxilina- eosina foi, em média, a mesma que a obtida quando se utilizou a coloração tricromo de Masson (p = 0,225).
c) No grupo submetido à aplicação de triancinolona, a área da reação granulomatóide medida quando se utilizou a coloração hematoxilina- eosina foi, em média, a mesma que a obtida quando se utilizou a coloração tricromo de Masson (p = 0,565).
d) As áreas das reações granulomatóides presentes nos cortes histológicos, submetidos à coloração hematoxilina-eosina e tricromo de Masson, foram maiores (respectivamente p = 0,005 e p = 0,003) quando se utilizou a solução salina do que quando se utilizou o acetato de triancinolona.
e) As menores áreas de reação granulomatóide foram encontradas nas lâminas em que os infiltrados inflamatórios foram menos intensos e estiveram relacionadas à aplicação do acetato de triancinolona, enquanto as maiores medidas foram verificadas nas lâminas em que os infiltrados inflamatórios foram mais intensos e estiveram relacionadas à aplicação da solução salina.
f) O peso dos animais componentes da amostra utilizada não apresentou correlação positiva com a dimensão das áreas de reação granulomatóide.
Anexo A - Protocolo de Pesquisa - Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Anexo B - Protocolo de Pesquisa - Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
Anexo C - Descrição dos dados referentes aos animais integrantes do grupo A do estudo piloto. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo - 2004
Coelho Olho Substância Colorações Infiltrado
inflamatório Peso (kg) 1 OD TRI HE / TM discreto 2,4 1 OE SAL HE / TM ausente 2,4 2 OD TRI HE / TM ausente 2,3 2 OE SAL HE / TM ausente 2,3 3 OD TRI HE / TM ausente 2,5 3 OE SAL HE / TM discreto 2,5 4 OD TRI HE / TM ausente 2,4 4 OE SAL HE / TM ausente 2,4 5 OD TRI HE / TM ausente 2,3 5 OE SAL HE / TM ausente 2,3
SAL - Solução de cloreto de sódio a 0,9% TRI - Triacinolona acetonida (40mg/cc) HE - Hematoxilina-eosina
Anexo D - Descrição dos dados referentes aos animais integrantes do grupo B do estudo piloto. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo - 2004
Coelho Olho Substância Colorações infiltrado
inflamatório Peso (kg) 1 OD SAL HE / TM moderado 2,3 1 OE TRI HE / TM discreto 2,3 2 OD SAL HE / TM discreto 2,4 2 OE TRI HE / TM ausente 2,4 3 OD TRI HE / TM discreto 2,3 3 OE SAL HE / TM discreto 2,3 4 OD TRI HE / TM ausente 2,2 4 OE SAL HE / TM ausente 2,2 5 OD TRI HE / TM discreto 2,4 5 OE SAL HE / TM intenso 2,4
SAL - Solução de cloreto de sódio a 0,9% TRI - Triacinolona acetonida (40mg/cc) HE - Hematoxilina-eosina
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