Os proprietários dos cães que tiveram o interesse e confirmaram a participação no projeto foram conscientizados sobre os objetivos do projeto de pesquisa e preencheram e assinaram o termo de consentimento animal. Assim, para a realização dos testes sorológicos, foram coletados cerca de cinco mL de sangue, sem anticoagulante, por punção da veia cefálica ou jugular. As amostras foram transportadas da clínica itinerante para o Laboratório de Patologia Clínica da Universidade de Rio Verde (UniRV), sob refrigeração. O sangue foi centrifugado para obtenção do soro e congelado até o momento da realização dos testes sorológicos.
As provas sorológicas empregadas foram DPP, realizado no Centro de Controle de Zoonoses do Município de Rio Verde/GO e os testes de RIFI e ELISA, no Laboratório de Imunoparasitologia do Departamento de Patologia Animal da FCAV/Unesp/Jaboticabal/SP.
Ao todo foram avaliadas 530 amostras de soros dos animais participantes da “Clínica itinerante nos bairros”. Essas amostras foram processadas, ELISA e RIFI, no Laboratório de Imunoparasitologia do Departamento de Patologia Veterinária da FCAV/Unesp/Jaboticabal/SP. O exame ELISA foi realizado nas 530 amostras, sendo as amostras reagentes processadas novamente na RIFI.
As amostras consideradas reagentes nos dois exames sorológicos foram separadas e a ficha de identificação, o questionário de diagnóstico de situação e o formulário veterinário dos mesmos foram novamente analisados. Os proprietários desses animais foram contactados para o agendamento de uma visita veterinária e nova colheita de sangue. Dos 20 animais reagentes três não
foram encontrados, sendo coletado sangue de 17 animais. Essas amostras foram centrifugadas e aliquotadas em eppendorfes. A alíquota de soro fresco foi utilizada para a realização Teste imunocromatográfico rápido em dupla plataforma (Dual Path Platform - DPP) no Centro de Controle de Zoonoses do Município de Rio Verde/GO.
4.3.1. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
O ELISA-teste foi utilizado para avaliação sorológica de 530 amostras de cães. O teste utilizando antígeno total solúvel de Leishmania chagasi, foi realizado conforme descrito por Oliveira et al. (2008), com ligeiras modificações, para os soros de cães de áreas endêmicas.
Os ensaios de ELISA foram realizados em placas de fundo chato (Maxisorp, Nunclon TMSurface, Nunc. Denmark). Foram adicionados 100L do antígeno solúvel de L. chagasi, diluído na concentração de 10 g/mL em tampão carbonato-bicarbonato de sódio 0,05M, pH 9,6, em cada cavidade das microplacas. Após incubação da placa por 8 a 10 horas em câmara úmida a 4oC, o excesso de antígeno foi removido por três lavagens consecutivas, com tampão PBS 0,01M, pH 7,4, contendo 0,05% de Tween 20 (PBS-Tween 20). As placas foram bloqueadas com PBS-Tween 20, acrescido de 6% de leite em pó, em câmara úmida, a 37oC por 90 minutos. Após nova lavagem para retirada do
bloqueador, foram adicionados, em duplicata, 100 L dos soros testes e dos soros de referência positivos e negativos diluídos 1: 400 em PBS-Tween 20, com 5% de leite em pó desnatado.
As microplacas foram então novamente incubadas a 37ºC por 90 minutos e lavadas, como descrito anteriormente; 100 L do conjugado canino acoplado à fosfatase alcalina (Ig de coelho anti IgG de cão, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA, cat. # A-0793), diluído 1:4.000 em PBS-Tween 20, acrescido de 5% de soro de coelho, foram adicionados a cada cavidade da placa, seguindo- se nova incubação e lavagem como as anteriores. O substrato da enzima fosfatase alcalina (paranitrofenilfosfato diluído a 1mg/mL em tampão dietanolamina pH 9,8; Sigma-Aldrich, St. Louis, USA, cat. # N-9389) foi adicionado, incubando-se a reação por 30 minutos à temperatura ambiente.
Decorrido esse período, a leitura foi realizada em um leitor de microplacas de ELISA (Microplate Reader MRX TC Plus, Dynex Technology), a um comprimento de onda de 405 nm.
4.3.2. Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI)
A RIFI foi utilizada para avaliação sorológica de 20 amostras reagentes no ELISA. A reação foi realizada conforme a técnica utilizada pelo Centro de Pesquisas Rene Rachou/FIOCRUZ, de Belo Horizonte/MG, para diagnostico de animais infectados por L.chagasi.
O meio de cultura em que se encontravam os parasitas foi centrifugado a 735G, por dez minutos, e o sobrenadante descartado. Posteriormente, foram feitas três lavagens dos parasitas com solução de albumina bovina (BSA) a 1%.
Após a terceira lavagem, foi colocada uma solução de paraformaldeido a 4%, por 30 minutos, para a fixação dos parasitas. Com a fixação, os parasitas foram novamente lavados por três vezes com solução de BSA a 1%, e o “pallet” de parasitas ressuspendido em solução salina tamponada (PBS) até a concentração de 3x106 a 4x106 parasitos por mL.
Utilizando-se lâminas previamente demarcadas com círculos, foram colocados 10μL da suspensão de parasitas em PBS em cada círculo. Após secagem por 6 a 8 horas a temperatura ambiente, as lâminas foram devidamente embaladas em papel extra-fino e papel alumínio, e estocadas a - 20ºC, em recipiente hermeticamente fechado, até o momento do uso.
As lâminas preparadas foram retiradas do “freezer” e descongeladas em temperatura ambiente. Em cada circulo contendo o antígeno, foram dispensados 10μL de cada soro teste diluído na concentração de 1:40. As laminas foram então incubadas em estufa bacteriológica na temperatura de 37ºC, retiradas após 30 minutos e, a seguir, submetidas a três lavagens em PBS por imersão, de cinco minutos cada. Apos secagem a temperatura ambiente, os círculos das lâminas foram recobertos com 10μL do anticorpo anti-IgG de cão conjungado ao isotiocianato de fluoresceína (KPL cat n_ 02-19- 02), diluído a 1:30, em soluço PBS, contendo azul de Evans 1mg%. As lâminas foram novamente incubadas e lavadas conforme descrito acima. Após a
secagem das laminas, essas foram montadas com lamínula, utilizando-se glicerina tamponada a uma relação de 9:1 de glicerina/tampão carbonato- bicarbonato 0,5M pH 9,6 e, posteriormente, observadas em microscópio equipado para fluoresceína (Olympus, BX-FLA).
As amostras séricas positivas na diluição de 1:40 foram novamente testadas. Em cada circulo contendo o antígeno, foram dispensados 10μL das diluições sucessivas dos soros testes positivos. A titulação dos soros testes positivos foi realizada diluindo-se cada soro a partir de 1:40, base 2, até a negativação do mesmo. Apos a leitura em microscópio equipado para fluorescência, foram consideradas positivas as reações fluorescentes em soros com diluição ≥ 1:80.
4.3.3. Teste imunocromatográfico rápido em dupla plataforma (Dual Path Platform - DPP) (BIO-MANGUINHOS, 2011)
Para a avaliação pelo teste imunocromatográfico rápido (DPP) foram utilizadas amostras de soro, e a metodologia utilizada foi de acordo com as recomendações contidas no “kit, descrita abaixo.
Com um dispositivo fornecido pelo “kit”, coletou-se uma gota do soro (cerca 5μL) previamente descongelado e aplicou-se no poço de n° 1 do suporte do teste, sendo adicionado em seguida 2 gotas de tampão. Após 5 minutos, foi aplicado 4 gotas do mesmo tampão no poço de n° 2 e aguardou-se vinte minutos. O teste foi considerado positivo quando duas bandas, uma referente ao controle do teste e outra referente à amostra testada, aparecessem dentro de 15 minutos. O teste foi considerado negativo, quando apenas a banda referente ao controle apareceu. Caso nenhuma banda fosse visualizada, o teste seria considerado inválido e deveria ser repetido, utilizando outro “kit”.
4.4. Geoprocessamento dos domicílios onde foram encontrados animais