Avaliação da viabilidade celular

Os resultados de viabilidade celular estão demonstrados nas Figuras 7 e 8. As substâncias isoladas pteroginina e pteroginidina foram testadas nas concentrações de 0,312 a 10 mM por meio do ensaio de citotoxicidade, baseada na redução do MTT, obtendo-se o resultado da porcentagem da viabilidade celular em relação ao controle negativo. O gráfico concentração-resposta é uma das formas onde melhor se visualiza a atividade antiproliferativa das amostras testadas. Com esse tipo de gráfico é possível verificar se a substância em questão possui efeito citocida (acima do ponto zero e abaixo de 50 %) e perfil concentração-dependente (ROUTH 1971). Os tratamentos com pteroginina e pteroginidina por 24 horas (t0) e tratamento de 24 horas seguido de

recuperação de 24 horas (t24), foram avaliados para as linhagens celulares HaCaT,

HeLa, SiHa e C33A.

Como esperado, os ensaios de citotoxicidade com ambos os alcalóides nos tempos t0 e t24 demonstraram que os queratinócitos normais de pele (HaCaT) foi a

linhagem mais sensível ao tratamento com maior porcentagem de morte celular em comparação com as demais linhagens tumorais cervicais: HeLa, SiHa e C33A que demonstraram-se mais resistentes aos tratamentos (Figuras 7 e 8). Para todas as linhagens celulares foi observado que durante os tratamentos (t0 e t24 ) com pteroginina e

pteroginidina, houve aumento da citotoxicidade concentração-dependente.

Na Figura 7 (A e B) estão apresentados os tratamentos com pteroginina nos tempos t0 e t24 em linhagens HaCaT, HeLa, SiHa e C33A. Nota-se a semelhança no

perfil tóxico de pteroginina nos diferentes tempos: t0 e t24 para todas as linhagens, com

valores de CI50 para HaCaT = 0,312±0,006 mM, HeLa = 1,87±0,011 mM, SiHa

=2,5±0,009 mM e para C33A = 0,625±0,012 mM no tempo t0 de tratamento. Tanto no

encontrada na linhagem HaCaT, seguida posteriormente de C33A, HeLa e SiHa, na qual foi estabelecida seguinte ordem de citotoxicidade: HaCaT>C33A>HeLa>SiHa.

Da mesma forma, os tratamentos t0 e t24 foram realizados para a outra

substância isolada de P. nitens, a pteroginidina, nas linhagens celulares HaCaT, HeLa, SiHa e C33A como mostra as Figura 8A e 8B. No tratamento t0 com a substância

pteroginidina, uma maior atividade citotóxica foi encontrada em células HaCaT, seguida de HeLa, C33A e SiHa na concentração de 10 mM (Figura 8A). Já o tratamento t24

como mesmo alcalóide, (Figura 8B) apresentou perfil citotóxico diferenciado do tratamento t0 principalmente para a linhagem HaCaT, uma vez que o queratinócito

mostrou discreta recuperação ao efeito do tratamento com pteroginidina nas concentrações de 5 e 10 mM. A linhagem C33A também demonstrou direfente perfil de viabilidade celular no tempo t24 em relação ao t0, na qual foi observado menor sobrevida

celular (65% de células vivas) na concentração de 0,312 mM, enquanto, que nas maiores concentrações (5 e 10 mM) foi a linhagem mais sensível ao tratamento apresentando mais morte celular (Figura 8B).

Diferença estatística significativa foi observada entre HaCaT e HeLa durante o tratamento com pteroginidina (p<0,01) assim como para pteroginina (p<0,05), indicando que as células não-tumorais são mais sensíveis ao tratamento com esses alcalóides. Adicionalmente, no tratamento de 24 horas (t0) foi observada diferença

estatística significativa entre HaCaT tratada com pteroginina e HeLa tratada com pteroginidina (p<0,05), HaCaT tratada com pteroginidina e SiHa tratada com pteroginina (p<0,01) e HaCaT tratada com pteroginidina e HeLa tratada com pteroginina (p<0,01). Nenhuma significância foi observada para o tratamento com ambos os alcalóides, em 24 horas entre HeLa versus SiHa e HeLa ou SiHa versus C33A. Os valores de 50% da concentração inibitória para o crescimento celular (CI50)

foram expressos como a concentração resultante em 50% da redução do crescimento das células tumorais e foram calculadas através de regressão linear utilizando o programa GraphPad Prism® Version 5.01 demonstradas nas Tabelas 2 e 3.

Figura 7. Ensaio de citotoxicidade (MTT). Porcentagem de células vivas nas linhagens SiHa (■), HeLa (■), C33A (■) e HaCaT (■) tratadas com alcalóide pteroginina de Pterogyne nitens nas concentrações de 0,312 mM a 10 mM. (A) Tratamento por 24 horas (t0). (B) Tratamento de 24 horas seguido de 24 horas

de recuperação (t24). Os dados referem-se às médias de três experimentos independentes e erro padrão (M ± EP). CP (controle positivo). One way ANOVA

com pós teste Tukey. (*)p<0,01 (A) HeLa (p<0,01- CPx 0,312;0,625; e 1,25 mM), SiHa (p<0,01- CPx 0,312; 0,625;1,25; 2,5; 5; 10 mM), C33A (p<0,01- CPx 0,312; 0,625; 1,25; 2,5 mM) e HaCaT (p<0,01-CPx1,25; 2,5 mM). (B) HeLa (p<0,01-CPx1,25; 2,5 mM), SiHa (p<0,01-CPx1,25; 2,5; 5; 10 mM), C33A (p<0,01-CPx0,312;0,625;1,25 mM) e HaCaT (p<0,01-CPx0,312;0,625 mM). * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * A B

Figura 8. Ensaio de citotoxicidade (MTT). Porcentagem de células vivas nas linhagens SiHa (■), HeLa (■), C33A (■) e HaCaT (■) tratadas com alcalóide pteroginidina de Pterogyne nitens nas concentrações de 0,312 mM a 10 mM. (A) Tratamento por 24 horas (t0). (B) Tratamento de 24 horas

seguido de 24 horas de recuperação (t24). Os dados referem-se às médias de três experimentos independentes e erro padrão (M ± EP). CP (controle

positivo). One way ANOVA com pós teste Tukey. (*) p<0,01 (A) HeLa (p<0,01 – CPx0,312; 0,626; 1,25 mM), SiHa (p<0,01 – CPx0,312; 0,626; 1,25; 2,5; 5; 10 mM), C33A (p<0,01– CPx0,312; 0,626; 1,25; 2,5; 5; 10 mM; p<0,005 – CPx5; 10 mM) e HaCaT (p<0,01-CPx0,312 mM). (B) HeLa (p<0,01- CPx1,25 mM), SiHa (p<0,01-CPx1,25; 2,5; 5; 10 mM), C33A (p<0,01-CPx1,25 mM) e HaCaT (p<0,01-CPx1,25 mM).

* * * * * * * * * * * * * * * * * * A B

Tabela 2. Determinação da atividade citotóxica de pteroginina por meio da técnica de MTT no tratamento de 24 horas (t0) e no tratamento de 24 horas, seguidos de

recuperação em 24 horas (t24).

Citotoxicidade pelo ensaio de MTT de pteroginina

CI50 (mM)

Substâncias HaCaT HeLa SiHa C33A

pteroginidina (t0) 0,312±0,006 1,87±0,011 2,5±0,009 0,625±0,012 pteroginidina (t24) 0,308±0,006 2,5±0,004 3,0±0,014 0,623±0,008

Os valores de 50% da concentração inibitória para o crescimento celular (CI50) foram expressos como a

concentração resultante em 50% da redução do crescimento das células tumorais e foram calculadas através de regressão linear, utilizando o programa GraphPad Prism® Version 5.01.

Tabela 3. Determinação da atividade citotóxica de pteroginidina através da técnica de MTT no tratamento de 24 horas (t0) e no tratamento de 24 horas, seguidos de

recuperação em 24 horas (t24).

Citotoxicidade pelo ensaio de MTT de pteroginidina

CI50 (mM)

Substâncias HaCaT HeLa SiHa C33A

pteroginidina (t0) 0,303±0,005 2,6±0,013 2,5±0,015 2,5±0,001 pteroginidina (t24) 0,302±0,011 0,625±0,009 3,0±0,014 0,630±0,007

Os valores de 50% da concentração inibitória para o crescimento celular (CI50) foram expressos como a

concentração resultante em 50% da redução do crescimento das células tumorais e foram calculadas através de regressão linear utilizando o programa GraphPad Prism® Version 5.01.

Nos tratamentos de 24 horas, seguidos de recuperação em 24 horas (t24), foi

possível observar o aumento de citotoxicidade concentração-resposta, porém não houve significância estatística entre as linhagens com ambos os tratamentos. A avaliação comparativa de citotoxicidade do tratamento com a pteroginina entre as linhagens HeLa, SiHa, C33A e HaCaT foram realizadas para as diferentes concentrações (0,312; 0,625; 0,5; 1,25; 2,5; 5 e 10 mM) bem como no tratamento de 24 horas seguido de período de recuperação de 24 horas (t24). Não foi encontrada diferença significativa entre as

diferentes linhagens nem nos diferentes tempos de tratamento (t0 e t24) (Figuras7 e 8).

Embora não haja diferença estatística na citotoxicidade entre as linhagens, é possível observar que HaCaT apresentou maior morte celular (Figuras7A, 7B e 8A). Em contrapartida, menor frequência de morte celular foi observada sutilmente na linhagem SiHa na mesma condição de tratamento (Figuras 7A, 7B, 8A e 8B).

Quando o tempo de tratamento (t0 e t24) foi avaliado comparativamente,

observou-se o mesmo perfil de morte celular de todas as linhagens tratadas com pteroginina nos tempos de 24 horas (t0) e tempo de 24 horas seguido de recuperação

(t24). Entretanto, no tratamento com pteroginidina, a citotoxicidade foi menor para

células HaCaT e maior para C33A com 24 horas de recuperação (Figuras 8A e 8B). O tratamento com pteroginidina aparentemente foi mais citotóxico para as células SiHa nas concentrações 0,625 mM e 1,25 mM em 24 horas (t0) quando comparadas com o

tempo de recuperação (t24) mostrado nas Figuras 8A e 8B.

Os resultados mostram relativa semelhança no perfil tóxico dos alcalóides pteroginina e pteroginidina nas mesmas linhagens celulares e nos diferentes tempos de tratamento (t0 e t24). Em razão disto, para dar continuidade aos estudos posteriores foi

5.2.Determinação do perfil de variação das citocinas IFN- , TNF-α, IL-1 , IL-4 e