Avaliações da sensibilidade in vitro das amostras de Clostridium

difficile.

4.2.1 Metronidazol

Figura 08: Curva de distribuição de Clostridium difficile segundo diâmetro do halo de inibição (mm) com disco de metronizadol (5 µg). Representam a média de dois ensaios com arredondamento para número inteiro.

4 4 0 2 6 18 18 26 16 4 ₂ 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 % (n=50)

Figura 09: Curva de distribuição da MIC (µg/mL) do primeiro lote de testes para metronidazol entre os 50 isolados de Clostridium difficile.

Figura 10: Correlação entre a distribuição dos diâmetros dos halos de inibição (mm) de metronidazol (5µg) e a distribuição da MIC (µg/mL). (n=50).

A distribuição da figura 10, baseada nos pontos definidos pelo CLSI (documento M100-S24) mostra que metronidazol apresentou no primeiro lote

82 18 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 % (n=50) MIC (µg/mL)

de testes 50 cepas sensíveis ao antimicrobiano, com MIC ≤ 8µg/mL. A MIC50

foi de 1 µg/mL e a MIC90 foi de 2 µg/mL.

A distribuição da figura 10, baseada nos limites de sensibilidade/resistência para o metronidazol, de acordo com o EUCAST (documento 5.16) mostra que o metronidazol, apresentou para o primeiro lote de testes, todas as 50 cepas sensíveis, com MIC ≤ 2 µg/mL. Nesta bateria de testes a MIC50 foi de 1 µg/mL a MIC90 foi de 2 µg/mL. O coeficiente de Pearson

foi de -0,38 e o valor de p foi de 0,006489, ou seja, estatisticamente significativo.

4.2.2 Moxifloxacino

Figura 11: Curva de distribuição de Clostridium difficile segundo diâmetro do halo de inibição (mm) com disco de moxifloxacino (5 µg). Representam a média de dois ensaios com arredondamento para número inteiro.

A distribuição da figura 11 mostra que para o moxifloxacino houve quatro cepas (cepas de n° 03,14, 25 e 47) com ausência de halo de inibição, ou seja, halos de 6mm (semelhantes ao diâmetro do disco).

8 4 ₂ 6 0 4 2 6 18 22 ₁₆ 10 2 ₀ 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 6 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 % (n=50)

Figura 12: Curva de distribuição da MIC (µg/mL) do primeiro lote de testes para moxifloxacino entre os 50 isolados de Clostridium difficile.

Figura 13: Correlação entre a distribuição dos diâmetros dos halos de inibição (mm) de moxifloxacino (5µg) e a distribuição da MIC (µg/mL). (n=50).

Conforme o CLSI (documento M100-S24) os limites de sensibilidade/resistência da distribuição da figura 13 mostra que para o moxifloxacino, houve no primeiro lote de testes quatro cepas (03, 14, 25 e 47) resistentes (as mesmas cepas com ausência de halo de inibição para a metodologia de DD). Estas cepas apresentaram MIC ≥ 32µg/mL. Nesta

6 86 8 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 % (n=50) MIC (µg/mL)

primeira bateria de testes apresentou três cepas sensíveis e 43 cepas com MIC intermediária. A MIC50 e a MIC90 para a bateria de testes foi de 4µg/mL.

Segundo os limites de sensibilidade/resistência para o moxifloxacino de acordo com o EUCAST (documento 5.16) a análise da figura 13 mostra que o moxifloxacino apresentou no primeiro lote de testes quatro cepas (cepas de n° 03, 14, 25 e 47) resistentes ao antimicrobiano com MIC ≥ 32 µg/mL (as mesmas cepas consideradas resistentes para a metodologia de disco-difusão). Na primeira bateria de testes 46 cepas foram sensíveis ao antimicrobiano com MIC ≤ 4 µg/mL. A MIC50 e a MIC90 para o teste foi de 4µg/mL. O coeficiente de

Pearson foi de -0,84, ou seja, se uma variável aumenta a outra diminui e vice- versa. O valor de p foi menor que 0,00001.

4.2.3 Nitazoxanida

Figura 14: Curva de distribuição de Clostridium difficile segundo diâmetro do halo de inibição (mm) com disco de nitazoxanida (5 µg). Representam a média de dois ensaios com arredondamento para número inteiro.

Figura 15: Curva de distribuição da MIC (µg/mL) do primeiro lote de testes para nitazoxanida entre os 50 isolados de Clostridium difficile.

10 14 12 16 12 8 10 ₆ 4 8 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 % (n=50)

Distribuição dos halo de inibição (mm)

2 60 32 6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 % (n=50) MIC (µg/mL)

Figura 16: Correlação entre a distribuição dos diâmetros dos halos de inibição (mm) de nitazoxanida (5µg) e a distribuição da MIC (µg/mL). (n=50).

Para a nitazoxanida não existem critérios de interpretação para DD e MIC definidos por nenhuma instituição.

Os limites de sensibilidade/resistência para nitazoxanida foram calculados utilizando a planilha Excel ECOFFinder (Turnidge, 2006). A análise da figura 16, baseada nos pontos corte (ECOFF) mostra que a nitazoxanida apresentou no primeiro lote de testes todas as 50 cepas sensíveis ao antimicrobiano, com MIC ≤ 0,25 µg/mL, pois o ECOFF 95,0% estabelecido para nitazoxanida foi de 0,25 µg/mL. Para o primeiro lote de testes a MIC50 foi 0,06

µg/mL e a MIC90 de 0,12 µg/mL. O coeficiente de Pearson foi de 0,35, ou seja,

se uma variável aumenta a outra também aumenta e vice-versa. O valor de p foi de 0,012715, ou seja, estatisticamente significativo.

4.2.4 Teicoplanina

Para a teicoplanina não existem critérios de interpretação para DD e MIC definidos por nenhuma instituição.

Figura 17: Curva de distribuição de Clostridium difficile segundo diâmetro do halo de inibição (mm) com disco de teicoplanina (5 µg). Representam a média de dois ensaios com arredondamento para número inteiro.

2 16 28 20 20 4 ₂ 8 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 14 15 16 17 18 19 20 21 % (n=50)

Figura 18: Curva de distribuição de Clostridium difficile segundo diâmetro do halo de inibição (mm) com disco de teicoplanina (30 µg). Representam a média de dois ensaios com arredondamento para número inteiro.

Figura 19: Curva de distribuição da MIC (µg/mL) do primeiro lote de testes para teicoplanina entre os 50 isolados de Clostridium difficile.

2 ₀ 20 20 ₁₈ 14 16 6 2 2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 % (n=50)

Distribuição dos halos de inibição (mm)

6 26 60 8 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 % (n=50) MIC (µg/mL)

Figura 20: Correlação entre a distribuição dos diâmetros dos halos de inibição (mm) de teicoplanina (5µg) e a distribuição da MIC (µg/mL). (n=50).

O coeficiente de Pearson foi de 0,08, ou seja, se uma variável aumenta a outra também aumenta e vice-versa. O valor de p foi de 0,580767, ou seja, estatisticamente não significante.

Figura 21: Correlação entre a distribuição dos diâmetros dos halos de inibição (mm) de teicoplanina (30µg) e a distribuição da MIC (µg/mL). (n=50).

O coeficiente de Pearson foi de 0,06, ou seja, se uma variável aumenta a outra também aumenta e vice-versa. O valor de p foi de 0,678943, ou seja, não significante estatisticamente.

4.2.5 Tigeciclina

Figura 22: Curva de distribuição de Clostridium difficile segundo diâmetro do halo de inibição (mm) utilizando disco de tigeciclina (15 µg). Representam a média de dois ensaios com arredondamento para número inteiro.

Figura 23: Curva de distribuição da MIC (µg/mL) do primeiro lote de testes para tigeciclina entre os 50 isolados de Clostridium difficile.

6 8 20 10 10 12 16 10 6 0 0 2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 % (n=50)

Distribuição dos halos de inibição (mm)

0 6 86 6 2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 % (n=50) MIC (µg/mL)

Figura 24: Correlação entre a distribuição dos diâmetros dos halos de inibição (mm) de tigeciclina (15µg) e a distribuição da MIC (µg/mL). (n=50).

Os limites de sensibilidade/resistência para tigeciclina de acordo com EUCAST (documento 5.16) demonstraram que a distribuição da figura 24 para tigeciclina apresentou no primeiro lote de testes 49 cepas sensíveis com MIC ≤ 0,25 µg/mL e uma cepa resistente ao antimicrobiano, com MIC de 0,5 µg/mL. No primeiro lote de testes a MIC50 e a MIC90 foi de 0,12 µg/mL.

O coeficiente de Pearson foi de -0,23, ou seja, se uma variável aumenta, a outra diminui e vice-versa. Porém, o valor de p foi de 0,108091, ou seja, não significante estatisticamente.

4.2.6 Vancomicina

Figura 25: Curva de distribuição de Clostridium difficile segundo diâmetro do halo de inibição (mm) utilizando disco de vancomicina (5 µg). Representam a média de dois ensaios com arredondamento para número inteiro.

Figura 26: Curva de distribuição da MIC (µg/mL) do primeiro lote de testes para vancomicina entre os 50 isolados de Clostridium difficile.

6 14 22 26 26 6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 21 22 23 24 25 26 % (n=50)

Diâmetro do halo de inibição (mm)

42 50 8 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 % (n=50) MIC (µg/mL)

Figura 27: Correlação entre a distribuição dos diâmetros dos halos de inibição (mm) de vancomicina (5µg) e a distribuição da MIC (µg/mL). (n=50).

Baseado nos Limites de sensibilidade/resistência para vancomicina de acordo com EUCAST (documento 5.16), a análise da figura 27 mostra que a vancomicina apresentou para o primeiro lote de testes 29 cepas resistentes, com MIC > 2 µg/mL e 21 cepas sensíveis ao antibiótico, com MIC ≤ 2 µg/mL. Para o primeiro lote de testes a MIC50 e a MIC90 foram de 4µg/mL. O

coeficiente de Pearson foi de -0,51, moderada negativa, ou seja, se uma variável aumenta, a outra diminui e vice-versa. O valor de p foi de 0,000155, ou seja, estatisticamente significativo.

5 DISCUSSÃO

Estudos têm demonstrado que o Clostridium difficile é um dos principais microrganismos relacionados na patogênese de doenças diarreicas associadas ao uso de antimicrobianos, pois o desequilíbrio da microbiota intestinal pelo uso de antibióticos leva à proliferação desse patógeno, cujas manifestações clínicas podem ser graves e fatais em alguns casos (Murray, 2006).

Segundo Rennie et al. (2012), existem duas metodologias para testar a sensibilidade a antimicrobianos para bactérias anaeróbias: a diluição em ágar e o E-test, fornecendo resultados semelhantes. Para Erikstrup et al. (2012), o método de disco-difusão é confiável para TSA de Clostridium difficile.

Devido à falta de documentos recentes pelo CLSI e EUCAST relativos aos limites de sensibilidade de Clostridium difficile e as dificuldades decorrentes desse fato, realizamos as análises dos testes de sensibilidade aos antibióticos em separado, avaliando inicialmente a sensibilidade das cepas ao metronidazol, moxifloxacino, nitazoxanida, teicoplanina, tigeciclina, e posteriormente à vancomicina, onde a escolha dos antimicrobianos avaliados foi baseada em dados da literatura sobre drogas disponíveis para o tratamento de infecções por Clostridium difficile.

A literatura sobre a realização e interpretação dos testes de sensibilidade in vitro para Clostridium difficile contém dados conflitantes e ainda existem dúvidas sobre a acurácia e a inter-relação dos diferentes métodos disponíveis.

Existe uma dificuldade de interpretação do método de disco-difusão devido a não existirem pontos de corte definidos por nenhuma instituição, embora alguns pesquisadores considerem esta metodologia aceitável na determinação susceptibilidade a antibióticos para bactérias anaeróbicas, especialmente aquelas de crescimento mais rápido (Erikstrup et al., 2012).

Os coeficientes de correlação observados entre os diâmetros dos halos de inibição e Concentração Inibitória Mínima foram abaixo do esperado, tornando inviável o método de disco-difusão para determinação de sensibilidade aos antimicrobianos nitazoxanida, teicoplanina e tigeciclina.

O metronidazol e a vancomicina ainda são os principais antimicrobianos utilizados no tratamento de infecções por Clostridium difficile. O metronidazol tem sido recomendado como tratamento de primeira escolha para a doença leve. Por sua vez, a vancomicina é recomendada para terapia em caso de infecções graves e em casos de recorrências (Bagdasarian et al.,2015). No entanto, alguns estudos sugerem a existência de cepas com sensibilidade reduzida a esses fármacos (Alcides et al., 2007; Bujanda e Cosme, 2009; Dinh et al. 2015).

A distribuição do metronidazol (figura 10) baseada nos limites aceitáveis de sensibilidade/resistência para essa droga de acordo com CLSI (documento M100-S24), mostra que todas as 50 cepas deste estudo foram sensíveis ao antimicrobiano, com MIC ≤ 8µg/mL. A MIC50 foi de 1 µg/mL e a MIC90 foi de 2

µg/mL. O mesmo se confirmou para os limites de sensibilidade/resistência para o metronidazol de acordo com o EUCAST (documento 5.16). Todas as 50 amostras foram sensíveis, com MIC ≤ 2 µg/mL. Nesta bateria de testes a MIC50

foi de 1 µg/mL e a MIC90 foi de 2 µg/mL. O coeficiente de Pearson foi de -0,38 e

o valor de p foi de 0,006489, ou seja, estatisticamente significativo, sugerindo que halos de inibição ≥ 33mm possam ser interpretados como sensíveis pela método de disco-difusão.

Baseado nos limites de sensibilidade/resistência para vancomicina de acordo com EUCAST (documento 5.16), a distribuição para vancomicina (figura 27) mostra que a para o primeiro lote de testes 29 cepas resistentes, com MIC > 2 µg/mL e 21 cepas sensíveis ao antibiótico, com MIC ≤ 2 µg/mL. Para o primeiro lote de testes a MIC50 e a MIC90 foram de 4µg/mL. O coeficiente de

Pearson foi de -0,51, ou seja, moderada negativa. O valor de p foi de 0,000155, ou seja, estatisticamente significativo. Devido à moderada correlação, significância estatística e distribuição de halos de inibição das amostras próximos aos valores encontrados utilizando a cepa ATTC, sugere-se a utilização do método de disco-difusão para vancomicina, que halos com diâmetro ≥ 22mm possam ser considerados como sensíveis pelo método.

Considerando os limites de sensibilidade/resistência para o moxifloxacino de acordo com o CLSI (documento M100-S24) mostrou quatro cepas (03, 14, 25 e 47) com ausência de halo de inibição para a metodologia

de DD. Estas cepas apresentaram MIC ≥ 32 µg/mL. Segundo o CLSI (documento M100-S24) os testes mostraram três cepas sensíveis (11, 19 e 49) e 43 cepas com MIC intermediária. A MIC50 e a MIC90 para o teste de ágar-

diluição foi de 4µg/mL. Utilizando os pontos de corte do EUCAST (documento 5.16) para determinação dos limites de sensibilidade/resistência para moxifloxacino, observamos a presença de quatro cepas (03, 14, 25 e 47) resistentes ao antimicrobiano com MIC ≥ 32 µg/mL, ou seja, as mesmas cepas com ausência de halo de inibição para a metodologia de disco-difusão. O método mostrou 46 cepas sensíveis ao antimicrobiano com MIC ≤ 4 µg/mL, sendo as MIC50 e MIC90 de 4µg/mL.

Dessa forma, para o moxifloxacino houve uma boa correlação entre os métodos de disco-difusão e ágar-diluição, com coeficiente de Pearson de -0,84, ou seja, forte negativo e o valor de p foi menor que 0,00001. Além disso, as cepas 03, 14, 25 e 47 mostraram halos semelhantes de diâmetro do disco (06 mm) e MICs ≥ 32 µg/mL. A resistência às quinolonas é sugerida como marcador (screening) da presença da cepa hipervirulenta NAP1/BI/027 (McDonald, et al., 2005; Bartlett, 2006; Kuijper et al., 2007). Dessa forma, podemos sugerir que halos de inibição ≥ 18mm possam ser interpretados como sensíveis pela metodologia de disco-difusão.

A nitazoxanida tem se mostrado in vitro uma alternativa para tratamento de casos de infecções por Clostridium difficile, mantendo a atividade contra cepas resistentes ao metronidazol, com resultados comparáveis com a vancomicina em casos de recidivas e de infecções graves. Seu uso ainda é limitado no pela falta de ensaios clínicos, pois ainda são necessários mais estudos para esclarecer os limites de sensibilidade/resistência deste fármaco e a sua real eficácia terapêutica (Surawicz e Alexander, 2011; Ritter e Petri, 2013).

Devido à escassez de limites de sensibilidade/resistência para nitazoxanida, utilizamos a planilha Excel ECOFFinder (Turnidge, 2006). Baseados nos pontos corte (ECOFFs) realizados no Excel ECOFFinder, a nitazoxanida foi eficaz com todas as 50 cepas sensíveis ao antimicrobiano com MIC ≤ 0,25 µg/mL. O ECOFF 95,0% estabelecido para nitazoxanida foi de 0,25 µg/mL. A MIC50 foi 0,06 µg/mL, sendo a mais baixa entre todas as drogas

utilizadas neste estudo. A MIC90 foi de 0,12 µg/mL. Com esses dados,

podemos concluir que a nitazoxanida foi à droga que mostrou melhor atividade in vitro para as 50 amostras deste trabalho, porém, não houve boa correlação entre os métodos de disco-difusão e de ágar-diluição, com coeficiente de Pearson de 0,35, ou seja, fraco positivo, inutilizando o método de DD para nitazoxanida (valor de p foi de 0,012715, ou seja, estatisticamente significativo). A teicoplanina é um glicopeptídeo que tem atividade in vitro contra o C. difficile. No entanto, resultados devem ser interpretados com cautela, uma vez que a equivalência entre as drogas foi obtida a partir de dois estudos com pequeno número de pacientes (Nelson et al. 2011; Ritter e Petri, 2013). Em nosso estudo, não houve boa correlação entre os métodos de disco-difusão e diluição em ágar para teicoplanina. O coeficiente de Pearson foi de 0,08 e valor de p foi de 0,580767 para a com concentração de disco de 5µg. Para a concentração de 30µg, o coeficiente de Pearson foi de 0,06 e valor de p foi de 0,678943, inviabilizando o método de DD para teicoplanina. Como referido para a nitazoxanida, a principal barreira para o uso de teicoplanina também está na falta de dados de ensaios clínicos e laboratoriais, e, assim, são necessários mais estudos para esclarecer os limites de sensibilidade/resistência para esta droga.

A tigeciclina é uma glicil-ciclina de uso intravenoso com amplo espectro de ação que inclui atividade contra o Clostridium difficile (Wilcox, 2007). Tem sido usada no tratamento de casos de CDI. Alguns estudos relataram falhas com esse antimicrobiano, levantando preocupações sobre o risco de resistência bacteriana a essa droga. Além disso, tem surgido preocupações sobre o aumento do risco de mortalidade associado à tigeciclina em infecções graves, o que resultou em um alerta do FDA (Food and Drug Administration) recomendando o uso de terapias alternativas em pacientes com infecções graves. Portanto, são necessários mais ensaios clínicos para avaliar a segurança e eficácia da tigeciclina em infecções por Clostridium difficile (Herpers et al, 2009; Lu et al. 2010; Ritter e Petri, 2013). Utilizando limites de sensibilidade/resistência para tigeciclina de acordo com o EUCAST (documento 5.16), verificamos 49 cepas sensíveis com MIC ≤ 0,25 µg/mL e somente uma cepa resistente ao antimicrobiano (cepa n° 03), com MIC de 0,5 µg/mL. A

MIC50 e a MIC90 foi de 0,12 µg/mL. O coeficiente de Pearson foi de -0,23, ou

seja, fraco negativo e o valor de p foi de 0,108091, ou seja, não significante estatisticamente, inviabilizando o método de DD.

O método de ágar-diluição é um método de boa acurácia, porém trabalhoso para ser executado na rotina laboratorial (Wust e Hardegger 1992; Olsson-Liljequist e Nord 1994; Rosenblatt e Gustafson, 1995; Wong SS et al., 1999).

Os resultados verificados neste estudo indicam a necessidade de mais estudos in vitro e clínicos para definir os limites de sensibilidade/resistência para a teicoplanina e a nitazoxanida, pois faltam critérios de interpretação tanto para disco-difusão quanto para ágar-diluição.

6 CONCLUSÃO

1. Devido à falta de correlação, significância estatística e de limites de sensibilidade/resistência, o método de disco-difusão parece pouco reproduzível para nitazoxanida, teicoplanina e tigeciclina;

2. Para o moxifloxacino houve boa correlação entre os métodos de disco- difusão e ágar-diluição, permitindo sugerir que para o moxifloxacino, halos de inibição ≥18mm possam ser interpretados como sensíveis pela metodologia de disco-difusão e halos com diâmetros <18 mm devam ser confirmados por metodologia dilucional;

3. Os resultados deste trabalho in vitro confirmaram a utilidade do metronidazol como uma droga eficaz no tratamento de infecção por Clostridium difficile. Para metronidazol, sugerimos que halos de inibição ≥33mm possam ser interpretados como sensíveis pelo método de disco- difusão e para cepas com halos de diâmetro <33mm, a sensibilidade/resistência deva ser confirmada por metodologia dilucional;

4. Devido à significância estatística e distribuição de halos de inibição das amostras próximos aos valores encontrados utilizando a cepa ATTC, sugere-se que para vancomicina, halos com diâmetro ≥22mm possam ser considerados como sensíveis pelo método de disco-difusão;

5. Não foi possível avaliar através das metodologias utilizadas neste trabalho os limites de sensibilidade/resistência para a teicoplanina, devido à ausência de pontos de corte para esta droga (CLSI e EUCAST);

6. Por se mostrar uma droga com potente atividade in vitro contra Clostridium difficile (MIC50 e a MIC90 de 0,12 µg/mL), a tigeciclina

difficile, dependendo de mais estudos in vitro e clínicos que avaliem a segurança e eficácia da droga;

7. A nitazoxanida foi à droga que mostrou melhor atividade in vitro por método dilucional, com a MIC50 de 0,06 e a MIC90 foi de 0,12 µg/mL,

sugerindo ser a nitazoxanida útil para o tratamento, devido a sua eficácia in vitro. Ensaios clínicos e laboratoriais são necessários para confirmar os resultados obtidos neste trabalho.

7 ANEXOS

ANEXO 01: Sensibilidade das amostras de Clostridium difficile (n=50).