de aorta (A). O peso molecular das bandas de MMP 2 (75 kDa, 72 kDa and 64 kDa MMP 2) foram identificados após eletroforese em gel a 12% SDS PAGE. PAD: padrão interno. Representação gráfica dos valores para cada peso molecular da MMP 2 nos extratos de aorta (B). Valores expressos como
média± EPM. (n=8/grupo) *'<0,05 para 2R 1C+veículo os quatro
não tratados (p<0,05). Para confirmar esses dados, a atividade das MMPs foi medida em extrato de aorta através de um ensaio de atividade gelatinolítica. A atividade das MMPs foi significativamente aumentada no grupo 2R 1C+veículo quando comparada aos demais grupos ('<0,05; Fig. 12).
5) B(' (A) Efeito dos tratamentos na atividade gelatinolítica, atividade
gelatinolítica e nos níveis de MMP 2 nas aortas. Fotografias
representativas de aortas (x400) incubadas com DQ gelatin, anticorpo anti MMP 2 e sobreposição das imagens.
5) B(' (B) Representação gráfica da atividade gelatinolítica , em que a intensidade de fluorescência verde reflete a atividade enzimática via degradação da gelatina (fluoróforo) (n=4/grupo). (C) dos níveis de MMP 2, avaliada como intensidade de fluorescência vermelha (n=4/grupo).(D) Atividade gelatinolítica total em extrato de aorta dos oito grupos experimentais. Valores expressos como média± EPM. *'<0,05 para 2R 1C+veículo os quatro grupos controle. #'<0,05 para 2R 1C+tratamentos 2R 1C+veículo.
Os níveis de MMP 2 também foram avaliados pelo método de imunohistoquímica. Observa se na figura 13 que houve um aumento significativo da expressão da MMP 2 no grupo 2R 1C+veículo, quando comparado aos grupos controles (p<0,05; Figura 13A e 13B). Os tratamentos com SPRL, HCTZ ou com ambas as drogas diminuíram a expressão da enzima nas aortas dos ratos hipertensos (p<0,05). Os tratamentos não alteraram os níveis de MMP 2 nos animais controles (p>0,05).
Não foram observadas alterações na expressão do TIMP 2 entre os oito grupos experimentais (p>0,05; Figura 14A e 14B). Entretanto a razão MMP 2/TIMP 2 foi maior para os animais hipertensos não tratados quando comparada aos animais controles (p<0,05; Figura 14C). Os tratamentos com SPRL, HCTZ ou com ambas as drogas diminuíram essa razão (p<0,05), sem alterá la nos animais controles (p>0,05).
5) BC' Efeito dos tratamentos na expressão da MMP 2 em aortas. Fotografias representativas (x400) da expressão de MMP 2 em marrom na camada média e endotélio das aortas dos oito grupos experimentais (A). Representação gráfica da atividade da expressão de MMP 2(B), quantificado analisando a intensidade de marrom. Valores expressos como média± EPM. (n=4/grupo) *'<0,05 para 2R 1C+veículo os quatro grupos controle. #'<0,05 para 2R 1C+tratamentos 2R 1C+veículo.
5) BA' Efeito dos tratamentos na expressão do TIMP 2 em aortas. Fotografias representativas (x400) da expressão de TIMP 2 em marrom na camada média e endotélio das aortas dos oito grupos experimentais (A). Representação gráfica da atividade da expressão de TIMP 2 (B) e razão MMP 2/TIMP 2 (C), quantificados analisando a intensidade de marrom. Valores expressos como média± EPM. (n=4/grupo) *'<0,05 para 2R 1C+veículo
os quatro grupos controle. #'<0,05 para 2R 1C+tratamentos 2R
) *
Os principais resultados do presente estudo foram: (I) o tratamento da hipertensão 2R 1C com SPRL, HCTZ, ou a combinação das drogas produziu efeitos anti hipertensivos e impediu as alterações vasculares estruturais e funcionais associadas a este modelo de hipertensão, (II) enquanto o tratamento com SPRL produzido menor efeito anti hipertensivo comparado ao com HCTZ ou com a combinação das drogas, o tratamento com ambas as drogas ou a combinação produziu efeitos antioxidantes e diminuiu os níveis e atividade da MMP 2 nos ratos hipertensos. Este é o primeiro estudo a avaliar os efeitos desses medicamentos sobre MMPs no modelo 2R 1C de hipertensão renovascular.
Sabe se que o aumento da pressão arterial induz mudanças duradouras na parede arterial vascular (Safar, London , 1998), que podem resultar da interação de vários mecanismos (Intengan e Schiffrin, 2001). Como pode ser observado na análise morfológica realizada nesse trabalho, os animais hipertensos presentaram um aumento do numero de células na camada média das aortas, sem redução no diâmetro do lúmen. Esse tipo de remodelamento é classificado como hipertrófico, característico de artérias de condutância (Duprez, 2006), com consequente aumento na AST e na razão M/L. As MMPs, como citado anteriormente, participam do remodelamento vascular por degradar componentes da matriz extracelular, promover proliferação e migração de células musculares lisas, e hipertrofia celular (Intengan e Schiffrin, 2001; Bouvet, Gilbert , 2005).
Nossos resultados bioquímicos (métodos de zimografia, imuno histoquímica e imunofluorescência para MMP 2) mostram um aumento na expressão vascular dessa enzima nos animais hipertensos. De forma similar aos nossos resultados, o aumento dessa enzima foi observado em animais 2R
1C (Castro, Rizzi , 2008; Castro, Rizzi , 2009) e em diferentes
modelos de hipertensão (Bouvet, Gilbert , 2005), e esse aumento foi associado à alterações vasculares estruturais e funcionais.
Como citado na introdução, algumas evidências sugerem que a MMP 2 está envolvida na modulação do tônus vascular por clivar alguns peptídeos vasoativos. Estudos mostraram que ela pode clivar a Big ET 1 em um metabólito com potente ação vasoconstritora, a ET 1(1 32), o CGRP em
metabólitos com menor ação vasodilatadora. Além disso cliva a
adrenomedulina em metabólitos com ações vasoconstritoras (Fernandez
Patron, Radomski , 1999; Fernandez Patron, Stewart , 2000;
Martinez, Oh , 2004). Por meio dessas ações essa enzima pode estar envolvida na manutenção na disfunção endotelial encontrada em modelos de hipertensão arterial.
Neste trabalho, observou se que o tratamento dos animais hipertensos com SPRL produziu pequeno efeito anti hipertensivo nos animais hipertensos. Essa pequena redução foi associada à normalização morfológica completa da parede vascular. Isso sugere que a aldosterona seja um importante mediador das alterações funcionais e morfológicas induzida pela hipertensão 2R 1C.
Além disso, os animais hipertensos não tratados apresentaram relaxamento vascular dependente do endotélio prejudicado em comparação
aos animais controles. O tratamento com SPRL produziu uma melhora da resposta dependente do endotélio. Nenhuma diferença entre animais hipertensos ou controles foi observada na resposta independente do endotélio, sugerindo que a disfunção endotelial possa ser o principal responsável pelas alterações encontradas na função vascular.
De forma similar aos nossos resultados, o tratamento com SPRL melhorou alterações vasculares estruturais e funcionais induzidas pela administração de angiotensina II em ratos (Virdis, Neves , 2002). Outros estudos mostram que o tratamento crônico com antagonistas dos receptores mineralocorticóides melhorou o relaxamento dependente do endotélio e o remodelamento da aorta de ratos espontaneamente hipertensos e na insuficiência cardíaca (Thai, Do , 2006; De Las Heras, Ruiz Ortega , 2007; Sartorio, Fraccarollo , 2007).
Embora os efeitos produzidos pela SPRL possam diferir
significativamente daqueles produzidos pelo antagonista mineralocorticóide seletivo eplerenone, os nossos resultados são consistentes com a idéia de que o bloqueio dos receptores mineralocorticóides atenua o remodelamento cardiovascular da hipertensão, independentemente da normalização da pressão arterial (Burla, Neves , 2007).
Neste trabalho, os animais hipertensos que receberam tratamento com SPRL apresentaram níveis reduzidos de MMP 2, por isso sugere se que essa redução possa ter sido uma das responsáveis pela melhora da resposta dependente do endotélio encontrada nas aortas nos ratos hipertensos tratados.
Como citado anteriormente, a MMP 2 é uma enzima constitutiva que sofre influência de vários fatores para sua ativação. Enquanto observamos nesse estudo um aumento dos níveis vasculares de MMP 2 nos animais hipertensos, os níveis de seu maior inibidor endógeno, o TIMP 2, analisados por imuno histoquímica, não foram alterados na aorta dos diferentes grupos experimentais. Assim, aconteceu um desequilíbrio na razão MMP 2/TIMP 2 nos animais hipertensos, e como os TIMPs são importantes inibidores das MMPs, é possível que esse desequilíbrio que tenha sido um dos responsáveis pelo aumento da atividade gelatinolítica e no extrato das aortas dos animais hipertensos. Esse aumento na atividade dos animais hipertensos foi revertido pelo tratamento com SPRL. De acordo com esses resultados, alguns trabalhos mostram que o antagonismo do receptor mineralocorticóide reduziu a quantidade de MMPs em cães com insuficiência cardíaca, e que previniu ou atenuou mecanismos pró fibróticos, incluindo aumento da expressão de colágeno, fibronectina, da MMP 2 e da MMP 9 em miócitos cardíacos de ratos estimulados com aldosterona (Rude, Duhaney , 2005; Rastogi, Mishra
, 2007).
Outro parâmetro avaliado nesse estudo foi o estresse oxidativo. Como citado na introdução, EROs também participam do processo de remodelamento vascular, e são um dos fatores responsáveis pela ativação das MMPs (Visse e
Nagase, 2003; Kandasamy, Chow , 2009). De acordo com isso,
observamos uma umento nos níveis de EROs na camada média da aorta dos animais hipertensos, assim como o aumento da atividade da NADPH oxidase vascular nesses animais. A atividade da NADPH aumentada pode ser o
biodisponibilidade do NO, contribuir para a disfunção endotelial e para o remodelamento vascular, características muito importante no modelo de hipertensão renovascular 2R 1C (Lerman, Chade , 2005).
Neste estudo, o tratamento com SPRL produziu efeitos antioxidantes por diminuir a atividade da NADPH oxidase, e este resultado está de acordo com a menor produção do ânion superóxido observada pelo método de DHE, e com os menores níveis plasmáticos de MDA encontrados nos ratos hipertensos tratados com esse antagonista mineralocorticóide. Essa diminuição de EROs pelo tratamento com SPRL acompanhada da redução nos níveis e atividade da MMP 2 observada na hipertensão sugere que mecanismos antioxidantes podem ter efeitos que regulam a MMP 2, e que, assim, essa enzima pode ser uma das principais responsáveis pelas mudanças vasculares estruturais e funcionais observadas na hipertensão 2R 1C, independentemente do efeito anti hipertensivo produzido pela droga. Esses resultados confirmam resultados anteriores, em que drogas antioxidantes preveniram o aumento de MMP 2 na aorta, bem como as alterações funcionais e estruturais induzidas nesse modelo de hipertensão renovascular (Castro, Rizzi , 2009).
Enquanto a administração de SPRL aos animais hipertensos produziu menor efeito anti hipertensivo, a associação de HCTZ à SPRL demonstrou maior efeito na queda da pressão arterial. No entanto, essa melhora do efeito anti hipertensivo não foi associada com efeitos mais pronunciados sobre a função ou estrutura vascular. Além disso, não encontramos nenhum efeito benéfico adicional sobre o estresse oxidativo ou sobre os níveis e atividade da MMP 2 quando ambas as drogas foram administradas a ratos hipertensos. Estes resultados sugerem que o bloqueio dos receptores mineralocorticóides
possa ter revertido completamente as alterações críticas associadas à hipertensão 2R 1C.
Também é possível que o bloqueio dos receptores mineralocorticóides pela SPRL possa ter compensado as conseqüências deletérias da HCTZ induzidas por depleção de volume, como o aumento de angiotensina II e aldosterona (Koenig, Binner , 1991), que levam a um aumento nos níveis
de EROs e de MMPs (Rude, Duhaney , 2005; Johar, Cave , 2006).
Curiosamente, observamos nesse trabalho que os animais hipertensos tratados com HCTZ também apresentaram uma diminuição das alterações estruturais e funcionais características da hipertensão 2R 1C. Esses resultados confirmam estudos anteriores que mostram efeitos vasculares benéficos causados pelo tratamento com HCTZ em animais SHR (Mougenot, Mediani
, 2005). Entretanto, contrastam com outro estudo feito com ratos stroke prone SHR (SHRSP), em que a mesma dose de HCTZ não impediu
espessamento da camada média arterial (Contard, Sabri , 1993). É
provável que essa contradição se deva a diferenças significativas entre os modelos animais de hipertensão utilizados.
Apesar dessas diferenças, os efeitos antioxidantes produzidos pela administração de HCTZ podem ajudar a explicar os efeitos benéficos encontrados neste estudo. O tratamento com HCTZ inibiu a atividade da enzima NADPH oxidase vascular, inibindo assim o aumento dos níveis EROs em resposta à hipertensão arterial na parede dos vasos. Além disso, o efeito antioxidante produzido pelo tratamento dos animais hipertensos com HCTZ pode ter aumentado a biodisponibilidade do NO, o que explicaria a melhora da
função endotélio dependente observada neste estudo. O aumento da biodisponibilidade de NO foi observado em pacientes hipertensos tratados com HCTZ em um estudo anterior (Kedziora Kornatowska, Czuczejko , 2006). Já o fato de que o tratamento com HCTZ não foi capaz de reduzir os níveis plasmáticos de MDA pode ser explicado pela falta de especificidade da técnica de TBARS. O TBA reage com uma grande variedade de compostos, como açúcares, aminoácidos, uma variedade de aldeídos e bilirrubina, produzindo interferência nos ensaios colorimétricos e medições fluorimétricas do MDA (Knight, Pieper , 1988; Valenzuela, 1991).
Além do efeito antioxidante encontrado nos animais hipertensos tratados com HCTZ, os testes bioquímicos mostraram que os níveis e a atividade da MMP 2 foram reduzidos nesses animais. Assim, o efeito antioxidante produzido no tratamento com a HCTZ também pode ter diminuído o aumento da atividade da MMP 2 provocados pela hipertensão, impedindo o remodelamento vascular, conforme citado anteriormente (Martinez, Castro , 2008; Castro, Rizzi
) *
O tratamento com SPRL produziu efeito anti hipertensivo discreto, atenuou os níveis de MMP 2, e reverteu a disfunção endotelial associada à hipertensão 2R 1C. Os efeitos benéficos produzidos por essa droga parecem não ser totalmente dependentes de seu efeito anti hipertensivo e sugerem que ela possa evitar as alterações vasculares encontradas na hipertensão 2R 1C. Esses benefícios parecem resultar da redução do estresse oxidativo, que modula negativamente o aumento da MMP 2 e as alterações vasculares observadas nesse modelo experimental. A associação de SPRL com HCTZ não apresentou benefícios adicionais ao encontrado apenas com SPRL, embora a HCTZ sozinha efeitos semelhantes à SPRL atenuando o aumento de MMP 2 bem como as alterações funcionais e estruturais do modelo experimental estudado.
1 # 5 J
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