Bibliotecas de rDNA 16S

Os ácidos ribonucleicos ribossomais (rRNAs) são os biopolímeros mais adequados para estudos de diversidade, uma vez que os genes que os codificam (rDNAs) estão universalmente distribuídos entre os diferentes grupos de seres vivos, considerando-se a molécula de maior conservação existente. A sua variabilidade pode apresentar-se em maior ou menor extensão em diferentes regiões da molécula (Madigan et al., 1997e).

O gene rDNA 16S codifica para o RNA ribossomial 16S (rRNA 16S) contido na subunidade menor dos ribossomas (30S) dos procariontes. A análise da sequência deste gene é um método útil na microbiologia para a identificação bacteriana, sendo actualmente a abordagem mais comum para a análise de comunidades uma vez que:

a) os genes têm sequências de nucleótidos altamente conservadas entre várias bactérias; b) a conservação ou divergência entre sequências reflecte a evolução bacteriana e a relação filogenética;

c) cada espécie bacteriana tem a sua sequência única. Desta forma, determinadas regiões do gene que codificam o rRNA 16S são diagnosticantes e permitem identificar microrganismos, para além de serem uma ferramenta útil para o estudo da filogenia bacteriana (Han, 2006). Outra vantagem é a grande quantidade de sequências de rDNA 16S bacterianas disponíveis em bases de dados (Dahllöf, 2002).

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Com a utilização da PCR, fragmentos do gene rRNA 16S, presentes em amostras complexas podem ser selectivamente amplificados e clonados. Estes produtos podem ser usados para produzir bibliotecas ambientais de rDNA 16S, permitindo assim, obter informações sobre a diversidade, e também sobre as relações filogenéticas, dos organismos, cultiváveis ou não, presentes no ambiente (Pires et al., 2004). As sequências conservadas facilitam o desenho de primers para a amplificação e as regiões variáveis fornecem o poder discriminatório. Após a PCR, as sequências de nucleótidos dos amplicões são determinadas e comparadas com base de dados, de forma a calcular homologias (Han, 2006).

No entanto, a utilização de primers para rDNA 16S também pode ter desvantagens:

− As bactérias podem ter mais do que um gene de rRNA 16S (operões) no seu cromossoma, podendo variar muito o número de operões de espécie para espécie.

− Para além disso, estas cópias podem apresentar grande heterogeneidade na sua sequência (Tourova, 2003). A heterogeneidade do rRNA 16S entre múltiplas cópias dentro da mesma espécie pode causar problemas na interpretação da diversidade obtida a partir de uma biblioteca de clones ou de sequências de um padrão de bandas e nas conclusões relativas à diversidade e abundâcia (Dahllöf, 2002 e Janda et al., 2007).

− Este gene também carece de resolução ao nível da espécie. Algumas espécies dentro de um género ou mesmo de géneros diferentes podem ter sequências idênticas do gene rRNA 16S, o que torna difícil a diferenciação e classificação baseada unicamente na sua sequenciação (Han, 2006). A sequenciação deste gene tem baixo poder filogenético ao nível da espécie e da subespécie e pobre poder discriminatório para alguns géneros, sendo necessários estudos complementares de hibridação de DNA para fornecer resolução absoluta para estes problemas taxonómicos (Janda et

al., 2007).

Além de genes ribossomais, alguns genes funcionais de determinados grupos de microrganismos, também têm sido utilizados para a sua caracterização filogenética, como por exemplo os genes dsrA e apsA das SRB, que podem funcionar como marcadores filogenéticos deste grupo de bactérias e podem ser muito úteis especialmente quando se investigam relações estruturais-funcionais (Ben-Dov et al., 2007).

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4.2.1.6 DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) e TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis)

A electroforese em gel por acção de um campo eléctrico é frequentemente utilizada para separar e estimar o tamanho de fragmentos de ácidos nucleicos. Geralmente, a electroforese de DNA é realizada em gel de agarose. A principal limitação da electroforese em gel de agarose é o facto de não permitir distinguir fragmentos com o mesmo tamanho, mas com diferentes sequências.

As técnicas de DGGE e TGGE permitem analisar produtos de PCR de acordo com a sua sequência de pares de bases e não baseado em diferenças no tamanho dos produtos. Desta forma, permitem a determinação da diversidade genética de comunidades microbianas naturais e também a identificação filogenética dos microrganismos dessas comunidades (Muyzer et al., 1993).

A electroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) é um método de separação electroforético baseado em diferenças no comportamento de desnaturação de fragmentos de DNA de cadeia dupla (Muyzer et al., 1993). Baseia-se no facto de moléculas de DNA de igual tamanho e com sequências diferentes migrarem de forma diferente em géis de poliacrilamida, a temperatura constante (geralmente 60ºC), com gradientes desnaturantes, obtidos por adição de desnaturantes químicos como a ureia e a formamida. A sequência de nucleótidos de um fragmento de DNA definirá a posição do gradiente em que o DNA de cadeia dupla passa a cadeia simples e interrompe a sua migração no gel (Eyers et al., 2004).

A electroforese em gel com gradiente de temperatura (TGGE) é uma variação da técnica de DGGE, que utiliza um gradiente térmico com concentração constante de ureia e formamida. Com o aumento da temperatura as ligações de hidrogénio que ligam as cadeias de DNA rompem e estas começam a separar-se. A técnica baseia-se no facto da mobilidade da molécula de DNA diminuir à medida que as duas cadeias se separam e a temperatura exacta a que as cadeias se separam depende da sequência de nucleótidos (Eyers et al., 2004).

Estas técnicas representam uma poderosa ferramenta para estudos ecológicos com microrganismos, dado que moléculas de DNA com sequências diferentes apresentam taxas de migração diferentes nestes géis. Entre as possíveis aplicações destas técnicas estão:

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− a separação de fragmentos de DNA de interesse, como o gene que codifica para o rRNA 16S, previamente amplificados, a partir de uma amostra complexa, de forma a que cada banda no gel corresponderá a um microrganismo presente na comunidade em estudo, representando um filotipo. Sendo assim, a cada comunidade microbiana corresponde um padrão de bandas que lhe é característico e a identifica. Do mesmo modo, fazendo uma análise de determinada comunidade em diferentes momentos, podem obter-se diferenças no padrão de bandas que correspondem a alterações na diversidade e composição da comunidade microbiana (Eyers et al., 2004). A análise destas alterações pode constituir uma ferramenta útil na monitorização de processos industriais (Jan-Roblero et al., 2004 e Dar et al., 2005).

− a recuperação, a partir do gel, do DNA de cada banda isoladamente e proceder à sequenciação desse fragmento de DNA de modo a identificar o microrganismo. Pode ainda proceder-se à identificação por hibridação com sondas específicas (Muyzer et

al., 1993).

As análises DGGE/TGGE apresentam algumas limitações (Eyers et al., 2004).:

− O modo como a amostra é armazenada pode afectar a comunidade microbiana. Por exemplo o armazenamento em condições anaeróbicas ou aeróbicas ou o congelamento directo das amostras pode resultar em diferentes comunidades microbianas;

− Formação de produtos inespecíficos durante a PCR, por exemplo a formação de molécula quiméricas, que são compostas por partes das duas sequências originadas a partir dos moldes com uma elevada similaridade. Estes moldes competem com os

primers durante a fase de annealing do PCR. A formação destas moléculas pode

afectar a interpretação dos padrões DGGE/TGGE e conduzir a uma sobreavaliação de espécies microbianas;

− A análise de padrões pode ser ambígua quando são analisadas comunidades muito complexas. Estima-se que apenas as populações bacterianas presentes em mais do que 1% na comunidade podem ser detectadas por PCR-DGGE. Esta limitação pode ser ultrapassada através da utilização de primers específicos para determinados grupos.

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