BioEdit

Através desta ferramenta de edição e análise de alinhamentos foi possível detectar a presença de algumas regiões conservadas ao longo dos alinhamentos. A figura 4.7 mostra a presença de quatro regiões altamente conservadas após o alinhamento múltiplo das seqüências resultantes do sistema PAST para a DNA-polimerase do vírus Chlorella. Tendo em vista que o alinhamento é bastante extenso, as seqüências resultantes foram editadas de forma a mostrar na mesma tela os domínios mencionados.

Figura 4.7 – Tela gerada através do software BioEdit para o arquivo de alinhamento resultante do completa execução da ferramenta PAST para a seqüência de proteína da DNA-polimerase do vírus

Chlorella. Os blocos na cor vermelha indicam as regiões conservadas. Estão destacados também na

figura o vírus Chlorella e o Homo sapiens.

. Esta ferramenta também foi utilizada para efetuar um corte nas seqüências protéicas, a partir do primeiro domínio conservado identificado, com a finalidade de preparar o alinhamento para a próxima etapa, ou seja, a geração de uma árvore filogenética. Esse corte nas seqüências foi executado seguindo a metodologia do artigo de Luis P. Villarreal, mencionado anteriormente, como forma de confirmar a eficácia do sistema PAST através da análise dos resultados filogenéticos.

4.4.2. PHYLIP e MEGA

As figuras 4.8, 4.9 e 4.10 mostram, de duas formas, as árvores geradas pelo pacote de programas PHYLIP através da execução dos programas PROTDIST, que cria uma matriz de distâncias a partir do arquivo de alinhamento resultante da ferramenta ClustalW, e do NEIGHBOR, que, por sua vez, gera a árvore filogenética baseada na junção de vizinhos (neighbor-joining). Vale lembrar que as seqüências protéicas passaram por uma etapa de corte, na qual somente foram submetidas ao pacote PHYLIP as seqüências localizadas a partir da primeira região conservada identificada com o uso do software BioEdit.

Foi também utilizado o programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) para efetuar o desenho da árvore, tendo em vista que ele possibilita o reajuste dos ramos da árvore sem causar alterações no seu conteúdo.

Uma vez desenhada a árvore, optou-se por ilustrá-la de duas diferentes formas: uma árvore em sua forma tradicional (Figuras 4.8 e 4.9) e uma árvore em forma radial (Figura 4.10). Ambas foram geradas para a DNA-polimerase do vírus Chlorella.

A figura 4.8 ilustra a árvore completa gerada, onde pode-se identificar, pela linha vermelha, a proximidade entre o vírus Chlorella e o Homo sapiens. Nota-se, através da mesma, que o ramo da árvore comum aos dois organismos em estudo encontra-se em um nível intermediário da árvore, ou seja, apesar da grande diferença existente entre um vírus e o homem, é possível sugerir que ao longo da evolução, os vírus podem ter influenciado na composição do genoma humano através da tranferência de genes.

A figura 4.9 foi inserida para viabilizar uma melhor visualização dos organismos que se encontram próximos aos alvos do estudo, o vírus Chlorella e o Homo sapiens, tendo em vista que a figura 4.8, devido às suas proporções, não possibilita a identificação dos organismos.

Por fim, foi gerada uma árvore na forma radial, ilustrada pela figura 4.10, para servir de comparação com a reproduzida no artigo “A Hypothesis for DNA Viruses as the Origin of Eukaryotic Replication Proteins” publicado em 2000 e escrito por Luis P Villarreal e Victor R. DeFilippis, já mencionado no decorrer desta monografia, como forma de validar o sistema PAST através da comparação entre elas.

Pode-se notar, na figura 4.10, que trata-se de uma outra forma de visualizar e interpretar uma filogenia. Nota-se que tanto o vírus Chlorella como o vírus Feldmannia apresentaram certa proximidade com o Homo sapiens se comparados com outros organismos presentes na árvore, como, por exemplo, os vírus de herpes. É interessante ressaltar que o vírus Human herpes, apesar de ser um patógeno humano que utiliza a maquinaria da célula do homem, aparece em uma clade distante da dos vírus Chlorella e

Feldmannia. Essa observação proporcionada pela árvore novamente possibilita sugerir que

Figura 4.8 – Árvore filogenética completa, obtida pelo software MEGA e gerada pelo pacote de programas PHYLIP a partir do resultado da ferramenta PAST para a DNA-polimerase do vírus

Chlorella. Os organismos em destaque na cor vermelha indicam, em cima, a presença do Homo sapiens

e em baixo o vírus Chlorella. A linha vermelha destaca os ramos da árvore que ligam os organismos em questão.

Figura 4.9 – A figura mostra em detalhe a região da árvore filogenética que mostra a relação evolucionária entre o vírus Chlorella e o Homo sapiens em destaque.

Figura 4.10 – A figura ilustra uma árvore filogenética sem raiz gerada pelo conjunto de programas PHYLIP e desenhada pelo software MEGA na forma de radiação. Os organismos do estudo fram identificados e ressaltados na cor vermelha, bem como o caminho que descreve a distância evolutiva entre eles.

4.5. Ambiente Web

A figura 4.11 apresenta a tela principal da página web desenvolvida para a divulgação e disponibilização do sistema PAST. Pode-se notar a presença de duas barras de menus, uma superior que contém os links “Home”, “Créditos” e “Contato” e uma lateral esquerda, composta pelos links “Home”, “A Ferramenta”, “Alinhamentos”, “Comentários” e “Links”. Uma mensagem de abertura também é apresentada na página inicial.

Figura 4.11 – Página principal (Home) do ambiente web desenvolvido para disponibilização da ferramenta desenvolvida (PAST).

A figura 4.12 ilustra a página referenciada pelo link “A Ferramenta”, presente na lateral do ambiente web. Nota-se, a princípio, que tanto o topo da página, composto pelo nome da ferramenta e o logotipo da mesma, como o menu lateral e o rodapé da página web se mantêm presente. Isso irá ocorrer para todas as interfaces. Somente o bloco central da página é diferenciado de acordo com o link referenciado.

A página em questão, ilustrada pela figura 4.12, é responsável por realizar uma breve apresentação da ferramenta, mencionando as operações que poderão ser realizadas pelo sistema PAST.

Figura 4.12 – A figura ilustra a página “A Ferramenta” pertencente ao ambiente web do sistema. Trata-se de uma breve explicação a respeito do sistema desenvolvido.

A próxima figura, figura 4.13, ilustra a principal página do ambiente web desenvolvida, pois é responsável por executar o sistema PAST. Nota-se a presença de um campo para a introdução de textos na posição central da página. É nesse campo que a seqüência de interesse do usuário deverá ser inserida por ele.

A própria página presta orientação ao usuário no sentido de evitar que a ferramenta não seja executada por motivo de erros quanto ao conteúdo que deve ser inserido no campo determinado. Salienta-se que o formato de entrada da seqüência, que deverá ser

direcionada ao alinhamento, é o formato FASTA, e somente a seqüência deve ser inserida no campo.

Além disso, a figura 4.12 ainda mostra ao usuário que, no caso de dúvidas a respeito do funcionamento da ferramenta, ele poderá encontrar auxilio na página “A Ferramenta”, já mencionada, ou mesmo enviar um e-mail ao autor do site através do preenchimento de alguns campos dispostos no link “Contato”, no menu superior da página. A página referenciada pelo link “Contato” pode ser visualizada na figura 4.17.

Figura 4.13 – Figura que ilustra a página responsável por iniciar o sistema, ou seja, executar a ferramenta PAST.

O resultado obtido pela execução da ferramenta PAST pode ser visualizado na figura 4.14. No bloco central da página, estão dispostos dois links: “Visualizar o Resultado do BLAST”, que, quando clicado, apresenta o resultado gerado pela ferramenta (figura 4.15) e o link “Filtragem e execução do Clustalw”, quando clicado, executa a filtragem dos

dados e o alinhamento mútliplo, disponibilizando a resposta em uma nova página, ilustrada pela figura 4.16.

Figura 4.15 – Página de apresentação do resultado obtido pela execução da ferramenta BLAST.

Na figura 4.16, que apresenta o resultado obtido pela execução da ferramenta ClustalW, três arquivos são gerados. Para acessar esses arquivos, basta clicar sobre o link referente a cada um deles que, numa nova página, serão apresentados. Para salvá-los, deve- se clicar com o botão direito do mouse e escolher a opção “salvar”.

Figura 4.16 – Página de apresentação dos resultados gerados pela ferramenta ClustalW. São obtidos 3 arquivos que podem ser salvos ou, quando clicados, apresentarão seus respectivos conteúdos em uma nova página.

Figura 4.17 – Página “Contato” que possibilita ao usuário entrar em contato com o autor do site. Ao preencher os campos e clicar em “Enviar e-mail”, a mensagem será entregue no e-mail do autor do sistema.

A figura 4.18 ilustra a página de comentários. O acesso a essa página é feito pelo menu lateral através do click no link “Comentários”. Uma vez acessada, essa página irá proporcionar ao usuário efetuar seus comentários a respeito do ambiente web e do sistema PAST diretamente na página, possibilitando, inclusive, comentários que poderão resultar numa melhora tanto do ambiente como da ferramenta.

Figura 4.18 – Figura que ilustra a página de comentários do site. Através dessa página o usuário pode disponibilizar sua opinião á respeito do amboente web e da ferramenta.

Por sua vez, a figura 4.19 é responsável por apresentar a página “Links” que é acessada a partir do menu lateral esquerdo do ambiente web. Nessa página estão dispostos alguns endereços referentes às ferramentas de bioinformáticas utilizadas neste trabalho.

Quando o usuário clica sobre o link, uma nova página é aberta com o respectivo conteúdo do link.

Por fim, a figura 4.20 ilustra a página do sistema na qual o autor situa o usuário ao projeto desenvolvido, relatando os orientadores e a equipe do laboratório no qual o trabalho foi implementado, tecendo os agradecimentos a todos.

Figura 4.20 – Página de créditos, na qual o autor agradece à equipe do laboratório onde ele desenvolveu o trabalho.

4.6. Considerações Finais

De acordo com os resultados apresentados, o sistema PAST teve um desempenho satisfatório nas análises com a DNA-polimerase do vírus Chlorella, ou seja, na busca por similaridade de seqüências através dos alinhamentos executados. Quanto às outras

enzimas, a resposta obtida pelo alinhamento local das seqüências indicou que os resultados não foram significantes, tendo em vista que o alinhamento com o Homo sapiens, quando encontrado, para as enzimas helicase e ligase, não resultaram em alinhamentos com valores considerados significantes, ou seja, obtiveram valores de E-value para o alinhamento com o Homo sapiens muito alto, por esse motivo foram descartadas. Somente foi mantido no estudo as seqüências protéicas da DNA-polimerase do vírus Chlorella.

As análises filogenéticas apontam que a transmissão gênica ocorreu no sentido dos vírus para o hospedeiro. Somente nessas circunstâncias, genes do processo replicativo poderiam, agora, estar presentes em bactérias e eucariotos. Os dados obtidos utilizando-se a ferramenta PAST definem a suposição levantada por Villarreal e De Fillips no ano de 2000.

O pipeline PAST mostrou-se de grande utilidade como base para o desenvolvimento de estudos filogenéticos, podendo ser empregado para qualquer análise protéica que necessite de alinhamentos de seqüências.

CAPÍTULO 5

Conclusões e Perspectivas

Partindo-se do objetivo deste projeto, a metodologia foi testada e aprovada e os resultados considerados satisfatórios.

O sistema PAST desenvolvido cumpriu com o propósito de auxiliar no processo de pesquisa tendo em vista que tornou a execução das ferramentas um processo bastante simples, eliminando a necessidade de acessar diferentes ferramentas para efetuar alinhamentos e possibilitando uma filtragem dos dados para evitar redundância de organismos. A automatização de algumas etapas do processo tornou a pesquisa mais ágil e rápida.

Os resultados obtidos e apresentados nesse trabalho consolidam a eficácia e a confiabilidade do sistema.

Uma vez desenvolvido o sistema, novas pesquisas poderão ser feitas, inclusive com outros vírus, podendo-se também estender a outros organismos, como fungos, de forma a apoiar a hipótese em questão.

Trabalhos futuros poderão ser desenvolvidos com o intuito de aumentar a funcionalidade da ferramenta PAST, através da execução de alinhamentos, não só para seqüências de proteínas, como também para nucleotídeos. Além disso, pode-se também implementar o processo de análise filogenética no sistema através da automatização do processo de construção das árvores filogenéticas.

Um ponto importante a ser ressaltado é que o sistema não se restringe apenas à pesquisa realizada. Qualquer indivíduo que necessite efetuar uma pesquisa com proteínas e

necessite efetuar alinhamentos poderá se tornar um usuário do sistema PAST, o que denota uma grande abrangência do software no campo da pesquisa.

A hipótese de que vírus podem ter transferido parte de seu material genético para o homem, ao longo da evolução, pôde ser mais uma vez observada com os resultados apresentados pelo sistema PAST através da pesquisa realizada.

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Anexo A

O anexo A apresenta o resultado gerado pelo sistema PAST após a execução do script blast.pl. Esse resultado é decorrente da execução da ferramenta BLASTP para a DNA-polimerase do vírus Chlorella.

BLASTP 2.2.14

Reference: Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.

Database: All non-redundant GenBank CDS

translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF excluding environmental samples 3,894,824 sequences; 1,340,658,132 total letters

Searching Query=

(913 letters)

Sequences producing significant alignments: Score (bits) E-Value gb|AAC96553.1| PBVC-1 DNA polymerase [Paramecium bursaria Chlore... 1769 0.0 dbj|BAA35142.1| DNA polymerase [Chlorella virus K2] 1728 0.0

sp|P30320|DPOL_PBCVN DNA polymerase >gi|281076|pir||B42543 DNA-d... 1600 0.0 gb|AAK28963.1| DNA polymerase [Paramecium bursaria Chlorella vir... 444 e-122 gb|AAK28965.1| DNA polymerase [Paramecium bursaria Chlorella vir... 442 e-122 gb|AAK28930.1| DNA polymerase [Paramecium bursaria Chlorella vir... 442 e-122 gb|AAK28929.1| DNA polymerase [Paramecium bursaria Chlorella vir... 441 e-122 gb|AAK28924.1| DNA polymerase [Paramecium bursaria Chlorella vir... 437 e-120 gb|AAK28931.1| DNA polymerase [Paramecium bursaria Chlorella vir... 432 e-119 gb|AAK28956.1| DNA polymerase [Paramecium bursaria Chlorella vir... 424 e-116 gb|AAK28952.1| DNA polymerase [Paramecium bursaria Chlorella vir... 421 e-116 gb|AAK28923.1| DNA polymerase [Paramecium bursaria Chlorella vir... 421 e-116 gb|AAK28951.1| DNA polymerase [Paramecium bursaria Chlorella vir... 418 e-115 emb|CAD21389.1| probable DNA-directed DNA polymerase III [Neuros... 395 e-108 ref|XP_362488.1| hypothetical protein MG08071.4 [Magnaporthe gri... 387 e-105 gb|EAQ86462.1| conserved hypothetical protein [Chaetomium globos... 386 e-105 ref|XP_638283.1| DNA polymerase delta catalytic subunit [Dictyos... 386 e-105 gb|ABA91815.1| DNA polymerase delta catalytic subunit, putative,... 383 e-104 dbj|BAE44786.1| hypothetical protein [Candida albicans] >gi|7702... 381 e-103 emb|CAB58156.1| pol3 [Schizosaccharomyces pombe] >gi|19112916|re... 380 e-103 emb|CAA21949.1| DNA polymerase delta [Candida albicans] >gi|1312... 380 e-103 gb|AAA35303.1| DNA polymerase delta 380 e-103

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