3 MATERIAL E MÉTODOS
3.6 Bioensaio de crescimento inicial 1 Variáveis analisadas
Neste bioensaio, foi analisado o crescimento do hipocótilo, da radícula e a massa seca do hipocótilo e radícula das plântulas cultivadas de Parapiptadenea
rigida.
3.6.2 Metodologia
Os tratamentos definidos para essas variáveis foram ás diferentes concentrações do extrato de Hovenia dulcis Thunb. (uva-do-japão), Os extratos etanólicos obtidos por dois métodos de extração; maceração e percolação dos tecidos de plantas jovens e adultos, de folhas, pseudofrutos, sementes, casca e raiz, considerando da seguinte forma: delineamento inteiramente casualizado, quatro repetições de 10 sementes (uma por célula), tres concentrações (25, 50 e 100%) e mais o grupo controle dos extratos obtidos a partir dos caracteres morfológicos jovens e adultos, através de dois métodos de extração (maceração e percolação).
Portanto, todos os tratamentos e mais o grupo controle, foram determinados da seguinte forma: T1 = Concentração 0% (testemunha); T2 = Concentração de 25%; T3 = Concentração de 50%; T4 = Concentração de 100%.
Para testar a interferência dos metabólicos secundários sobre o crescimento inicial, foram utilizados os extratos provenientes do mesmo material botânico e os mesmo métodos de extração anteriormente descritos, em quatro repetições, com três tratamentos nas concentrações de 100, 50, 25%, mais o grupo controle, com 10 plântulas por recipiente. Inicialmente, foi realizada a assepsia das sementes com hipoclorito de sódio 2%.
A metodologia utilizada para a obtenção das plântulas foi usado recipientes bandejas plástica, medindo 40 x 50 x 10 cm, cobertas com plástico transparente e forradas com substrato de papel mata-borrão na medida das bandejas, previamente autoclavadas por 20 minutos a 120°C.
Para os experimentos foram utilizadas 45 caixas gerbox, 90 recipientes de 8,5 x 11 x 2 cm, contendo dois tipos de substratos: 1080 g de vermiculita e 720 g de Plant Max®. A partir da dissolução dos extratos etanólicos brutos na concentração de 100% foram obtidas as concentrações a 50% e 25%, as quais foram comparadas com o grupo controle (0%).
Para obtenção das plântulas cultivadas de P. rigida no crescimento, Iniciou-se o ensaio de germinação, umedecendo com água destilada o substrato e colocando as sementes nas bandejas, mantidas em câmara climatizada tipo BOD, com fotoperíodo de 12 h, com isotermal em 25 ± 2oC e irradiância de 45 µmol.m-2.s-1. Neste período, ocorreu a germinação em 36 hs, no tempo em que a protrusão das raízes alcançou 1 mm, o tamanho ideal para o transplante neste experimento.
O substrato usado no desenvolvimento das plântulas foi preparado na proporção de 60% de vermiculita e 40% de Plant-Max®, o qual foi previamente autoclavado por três vezes de 40 minutos a 120°C. Esta mistura dos substratos vermiculita e Plant-Max® foram utilizadas para a melhor fixação das plântulas nos recipientes, usados geralmente em testes de germinação.
Para a determinação da quantidade exata dos extratos a ser utilizada, após a mistura dos dois substratos, foram pesados 24 g de vermiculita mais 16 g de Plant-
Max®, totalizando 40 g por caixa de gerbox, para cada tratamento calculado na proporção de três vezes a média do peso dos substratos resultando 1 g do extrato vezes a massa do substrato totalizando 3 g. de extratos por célula. A seguir, foram umedecidos os substratos com extrato através de uma micro-pipeta monocanal de todos os tratamentos colocados os substratos na quantia equivalentes a 40 g em caixas gerbox já identificadas (padronizadas pela RAS), medindo 11 x 11 x 4 cm, após foram transferidas para estufas a 35°C durante 48 horas, para total evaporação do solvente. Depois de seco, os substratos com extratos de todos os tratamentos foram distribuídos para os recipientes com 24 células na quantia de 3 g/célula. Para o grupo controle foi distribuídos somente o substrato da mistura vemiculita e Plant- Max®. Posteriormente foram irrigado todos os tratamentos com água destilada na quantia de 3ml/célula inclusive o grupo controle.
Posteriormente, foi feito um pequeno orifício no substrato em cada célula para o transplante e possibilitar a pega uniforme das plântulas.
Após a identificação dos recipientes, foram colocados em caixas de maior tamanho, transparentes de polietileno, com tampa medindo 25 x 22 x 12 cm e encaminhados para a câmara climatizada tipo BOD, com fotoperíodo de 12 h, com isotermal em 25 ± 2oC e irradiância de 45 µmol.m-2.s-1. No 14º dia as caixas foram retiradas do BOD, sendo considerado concluído, o bioensaio quando ocorreu o terceiro estágio (fase) do desenvolvimento das plântulas. Após foi iniciada as medições do hipocótilo, radícula e a determinação da massa seca.
3.6.3 Cálculo das medidas do hipocótilo e radícula
Para a obtenção do comprimento, fizeram-se medidas das variáveis hipocótilo, radícula e determinação da massa seca nas zonas de diferenciação entre radícula/hipocótilo (considerando a distância dos cotilédones da plântula até o ápice meristemático do sistema radicular). Para facilitar a retirada das plântulas das caixas de crescimento, as células foram irrigadas e, na sequência, foi realizada a limpeza, antes do inicio do procedimento de determinação das medidas do hipocótilo e radícula com o auxilio de régua milimetrada, adaptada em pranchetas. Os resultados são dados em centímetro, conforme Benincasa (1988).
3.6.4 Determinação da massa seca (MS)
Depois de realizada a biometria das plântulas, elas foram separadas e o hipocótilo e a radícula foram seccionados, de acordo com o número de repetições e tratamentos. Ambos foram pesadas em balança com precisão de 0,0001 g, obtendo- se o valor pela soma de cada repetição dividido pelo número de plântulas utilizadas.
Os resultados foram expressos em mg/partes da plântula. A etapa de
secagem foi estudada através do equilíbrio higroscópico e da cinética de secagem. Para acompanhar a secagem e o equilíbrio foi necessário determinar a
umidade inicial das folhas pelo método da estufa e mantidas em estufa a 60ºC, até a estabilização do peso (em torno de 48 hs). A umidade inicial pode ser calculada em base seca e base úmida de acordo com as equações.
Para a determinação da matéria seca das plântulas, estas foram divididas por órgãos, pelo número de repetições e concentrações, acondicionadas em sacos de papel 18 x 10 cm, identificadas Decorrido o período, o material vegetal foi mantido em dissecadores com sílica para determinar o peso, em balança de precisão obtendo-se, assim, os valores de massa seca do total das plântulas (mg) pela diferença da massa inicial conforme equações.
Xi = wi/wi – ws (base úmida) Xi = ws/wi – ws (base seca) Onde:
Xi umidade inicial wi massa inicial
ws massa seca (mg)