Biorreactores

Os biorreactores representam a última etapa da produção de metabolitos em, por exemplo, culturas de células microbianas, células vegetais, tecidos ou órgãos de plantas. Estes permitem ampliar e controlar as condições de cultivo, podendo estar associado a sistemas automáticos levando a reduções de tarefas e custos de produção do composto pretendido a grande escala.

Existem várias considerações a ter em conta na ampliação de escala em sistemas microbianos, entre os quais podemos salientar o suprimento de nutrientes, a uniformidade da mistura, a adequada transferência de gases (por exemplo, o oxigénio e o gás carbónico), a homogeneidade do sistema durante todo o tempo necessário para o cultivo no biorreactor; falhas nas considerações atrás referidas podem levar à sedimentação e morte das células comprometendo o processo de fermentação (Waites et al, 2001)

Um biorreactor é sem dúvida um dos equipamentos fundamentais na Microbiologia industrial, neste ocorrem muitos processos biotecnológicos, sendo necessário que haja um rigoroso controlo dos parâmetros que afectam o crescimento celular e a síntese de produtos, é necessário que se assegure um ambiente uniforme e adequado à cultura.

Um biorreactor permite realizar uma série de procedimentos essenciais à amplificação da cultura (Pirt, 1975):

•••• Mantém as células uniformemente distribuídas em todo o volume da cultura a fim de prevenir a sedimentação ou a flutuação das células;

•••• Mantém constante e homogénea a temperatura; •••• Minimiza os gradientes de concentração de nutrientes;

•••• Adiciona oxigénio a uma velocidade adequada ao consumo do mesmo;

•••• A arquitectura do biorreactor deve ser tal que permita manter o cultivo puro; uma vez que todo o sistema é previamente esterilizado e posteriormente adicionada a cultura.

É portanto necessário recorrer a processos de optimização da produção de metabolitos para que os resultados sejam os esperados.

Um biorreactor pode se utilizado em “Batch” ou seja, em descontínuo, em que todos os componentes são colocados no meio desde o início do processo, desta forma as condições da cultura não são mantidas, o

substrato catabólico ou algum dos nutrientes essenciais à espécie em causa esgota-se, as condições do meio de cultura tornam-se inadequadas ao metabolismo do microrganismo devido à acumulação de metabolitos excretados, que atingem concentrações tóxicas ou alteram as condições do meio (ex. pH), tornando-se este, inibitório do crescimento das espécies em cultura. Em “Batch alimentado”, onde a alimentação dos componentes do meio se processa de uma forma controlada durante o processo, sendo desta forma proporcionadas as condições nutricionais ou ambientais necessárias para a continuidade do processo. Ou então, pode ser utilizado um biorreactor contínuo, “Cultivo contínuo”, no qual o meio é fornecido a uma determinada velocidade ao mesmo tempo que se retira com a mesma velocidade meio fermentado, o que permite determinar a velocidade de crescimento específico como variável independente (Pirt, 1975).

O comportamento de um microrganismo em crescimento é o resultado da interacção entre o próprio microrganismo e o meio ambiente no biorreactor. Este comportamento esta dependente de factores relacionados com própria biologia do microrganismo, factores intrínsecos, e factores relacionados com o meio envolvente, factores extrínsecos. Como factores intrínsecos consideram-se as características genéticas do microrganismo e os mecanismos de regulação metabólica. Estes últimos podem ser modificados por alterações ambientais mais precisamente pelos factores extrínsecos (temperatura, pH, composição do meio, etc).

Os factores extrínsecos de natureza física são dependentes das condições de manipulação utilizadas no biorreactor como é o exemplo da temperatura, da agitação, da oxigenação, etc. Estes factores são muito importantes no decorrer do processo, por exemplo se a temperatura usada não for a adequada esta pode diminuir ou mesmo impedir a formação do metabolito pretendido, ou ainda modificar os requisitos nutritivos do microrganismo (Waites et al, 2001). Os componentes de um meio de fermentação devem cumprir todos os requisitos nutricionais e restantes requisitos específicos que são indispensáveis para a formação do produto.

Num processo industrial podemos considerar quatro etapas para a produção em escala de determinado microrganismo (Fiechter, 1984):

•••• Propagação do cultivo, a qual se realiza em laboratório e inicia-se geralmente num tubo de ensaio que contém um inóculo do microrganismo ou num tubo liofilizado ou congelado, onde está conservada a estirpe de interesse ou uma colónia do microrganismo previamente seleccionada.

•••• Fermentação, com o material obtido anteriormente, procede-se à incubação num recipiente de inoculação que pode ter um volume de 50 a 1000L conforme a escala industrial posterior. Do recipiente de inoculação passa-se posteriormente ao biorreactor cujo volume varia de acordo com o produto que se vai obter e a sua concentração podendo chegar aos 1 000 000L. Um processo essencial a ter em conta no início desta fase é a preparação e esterilização dos meios tanto no recipiente de inoculação como no biorreactor.

•••• Processos de separação e purificação dos produtos, estas etapas estão compreendidas em quatro passos: a) separação dos insolúveis por filtração, centrifugação, ou decantação; b) separação primária por extracção, absorção ou ultrafiltração; c) purificação por extracção líquido-líquido, ou cromatografia de afinidade e d) isolamento do produto.

•••• Tratamento dos efluentes, embora não tenha uma relação directa com o produto esta etapa é imprescindível pois é fundamental controlar o efluente que sai da fábrica que é geralmente enviado para um curso de água.

Num processo industrial é extremamente importante a qualidade de uma estirpe microbiana, esta deve ter a capacidade de produção num biorreactor e não apresentar dificuldades nas etapas de separação e purificação. Ou seja, um biorreactor e as condições de operação devem assegurar a produtividade máxima do processo e a qualidade do produto.

Tendo em conta a relação entre crescimento celular e síntese do metabolito de interesse – quando o metabolito é produzido no final da fase de crescimento, considera-se o processo de produção em duas etapas, numa primeira fase é usado um biorreactor para a formação de biomassa e seguidamente um segundo para a produção do metabolito (Fowler, 1988; Su, 1995; Bourgaud et al., 2001 in http://www 2.enq.ufsc.br/teses/d009.pdf). Quando a produção do metabolito está associada ao crescimento celular, é efectuada uma única etapa para o crescimento das células e formação dos produtos ao mesmo tempo (Bourgaud et al., 2001 in http://www2.enq.ufsc.br/teses/d009.pdf).

No caso do metabolito permanecer no interior da célula, é necessário, lisar as células para que os produtos sejam recuperados, este processo é normalmente efectuado em processos fermentativos do tipo “Batch” ou “Batch alimentado”. Os produtos extracelulares podem ser recuperados a partir do meio de cultivo. Neste caso, pode recorrer-se a um cultivo contínuo, o qual representa maior produtividade frente aos outros processos (Bourgaud et al., 2001 in http://www2.enq.ufsc.br/teses /d009.pdf).

Para o cultivo de células livres, que é o caso do cultivo de microrganismos, existem dois tipos de biorreactores: os biorreactores mecanicamente agitados (com agitação com pás ou hélices) e os biorreactores pneumaticamente agitados como os biorreactores “air lifts” e coluna de bolhas (Wilson e Hilton, 1995 in http://www2.enq.ufsc.br/teses/d009.pdf).

Motor Nanómetro Saída de ar Saída de H2O Agitador Aereador Entrada de ar estéril Entrada da Amostra e meio Defector Água para refrigeração

Figura III - 15: Esquema de um biorreactor meca- nicamente agitado (Pirt, 1975).

Os biorreactores que serviram de base para a construção do biorreactor de pequena escala utilizado nas actividades laboratoriais desenvolvidas foram os mecanicamente agitados (figura III-15). Nestes o ar é injectado pela parte inferior do recipiente e é distribuído por uma coroa que possui pequenos orifícios equidistantes. O ar que sai de cada orifício é movimentado pelas paletas da turbina inferior gerando pequenas bolhas de ar, a partir das quais se difunde o oxigénio por todo o meio. O sistema de agitação completa-se com quatro ou seis defectores que têm a finalidade de contrariar o movimento circular que as turbinas transferem ao líquido gerando desta forma uma maior turbulência e maior mistura. O recipiente é revestido por uma capa pela qual circula água, permitindo um maior controlo da temperatura, para biorreactores maiores o controlo é feito de outras formas mais complexas. O ar que entra no biorreactor deve estar estéril, o que é assegurado fazendo-o passar por um filtro cujo diâmetro do poro deverá ser 0,45µm, o que impede a passagem de microrganismos e esporos (Pirt, 1975).

Capítulo IV