A biossíntese combinatória envolve a engenharia genética das vias biossintéticas naturais para a produção de novos compostos usando a maquinaria biossintética existente em cada organismo, especialmente para obtenção de antibióticos derivados policetídeos e peptídeos não ribossomais (WRIGHT; SUTHERLAND, 2007).
A complexidade estrutural dos produtos naturais, em muitos casos, faz com que seja difícil produzir análogos com atividades medicinais melhoradas. Em contraste, a biossíntese combinatorial explora a promiscuidade de substratos e emprega enzimas e vias modificadas para produzir novos produtos "não naturais", ampliando substancialmente a diversidade estrutural de produtos naturais com potencial de valor farmacêutico. Existem três vantagens da biossíntese combinatórial para a descoberta de medicamentos. Em primeiro lugar, ela ajuda a enriquecer a originalidade e a diversidade de produtos naturais, o que potencialmente melhora as suas características biológicas. Em segundo lugar, oferece uma forma ambientalmente amigável para produzir análogos de produtos naturais, enquanto a síntese química geralmente envolve múltiplos passos de reações de proteção/desproteção, condições adversas, solventes orgânicos tóxicos e resíduos de subprodutos. Em terceiro lugar, através da biossíntese combinatorial, a expressão heteróloga pode se tornar mais eficiente em alguns hospedeiros geneticamente maleáveis levando a um aumento de quantidade do composto, eventualmente resultando em drogas menos caras (SUN et al., 2015).
Em 1985 Hopwood clonou os genes biossintéticos do antibiótico actinorodina de
Streptomyces coelicolor nos microrganismos produtores de medermicina e di-
42 modificado geneticamente produziu, além de medermicina, grandes quantidades de uma nova substância mederorrodina, a qual contém um grupo hidroxila adicional característico da actinorodina. Já o Streptomyces violaceoruber Tü 22, modificado para produzir di-hidrogranaticina, produziu uma nova substância, di-hidrogranatirodina, preservando as configurações dos precursores nos estereocentros da nova molécula. Este trabalho representa a primeira utilização do conceito de biossíntese combinatorial de produtos naturais e abriu uma nova perspectiva para a diversificação estrutural de produtos naturais de interesse (HOPWOOD et al., 1985).
Outro exemplo mais recente de sucesso para a biossíntese combinatorial foi o trabalho elaborado por (BALTZ et al., 2006), cuja manipulação genética das vias biossintéticas de Streptomyces roseosporus, produtor da daptomicina, originou uma plataforma robusta com mais de 60 novos antibióticos lipopetídicos, os quais seriam dificilmente obtidos por síntese química.
Antibióticos glicopeptídicos oferecerem, em particular, uma excelente oportunidade para expansão química através da biossintese combinatorial, pois as rotas bissintéticas são conhecidas e eles possuem esqueleto estrutural conservado, além de uma ampla diversidade enzimática necessária para síntese dos antibióticos as quais podem ser utilizadas para obtenção de novos derivados (THAKER; WRIGHT, 2015). Os clusters de glicopeptídeos sequenciados até o momento revelam a presença de uma ou duas halogenases. Das halogenações que ocorrem em glicopeptídeos, a cloronação é a mais prevalente. Ela influencia na transmissão de estabilidade à molécula durante a fase de montagem e também na dimerização intramolecular de glicopeptídeos em solução.
O antibiótico A47934 (Figura 12), um glicopeptídio produzido por Streptomyces
toyocaensis possui modificações na estrutura do antibiótico que são decorrentes de duas
halogenases e transferases ativas. Entretanto, essas halogenases identificadas no cluster gênico parecem adicionar três substituintes de cloro para os aminoácidos aromáticos do composto. Este antibiótico, que tem uma estrutura peptídica idêntica à teicoplanina, porém é sulfonado no N-terminal do resíduo de p-hidroxifenilglicina e não é glicosilado. O espectro biológico de A47934 é semelhante ao de outro glicopéptideos e inclui atividade contra bactérias aeróbicas e anaeróbicas Gram-positivas. Os dois genes previstos para produzir as halogenases em seu grupo de genes são nomeados staI e staK. A halogenase StaI é homóloga a ORF10 e BhaA de biossíntese de cloroeremomicina e balhimicina, respectivamente (PUK et al, 2002). Assim, acredita-se que a StaI deve ter
43 uma função similar na biossíntese A47934, que catalisa a adição de substituintes de cloro para as posições 2 e 6 do peptídeo intermediário. Experimentos genéticos indicam que -hidroxitirosina não é um substrato para as halogenases livres e, portanto, a halogenação deve ocorrer na cadeia peptídica em crescimento, ou seja, sobre os intermediários peptídicos ligados à tioésteres com o domínio PCP da peptídeo sintase não-ribossomal (NRPS) (PUK et al., 2004). No entanto, a temporização dos passos de halogenação para a biossíntese de glicopeptídeos não têm até agora sido definidos. StaK também é inferida ser uma halogenase, embora a sua semelhança com outras halogenases do cluster gênico da biossíntese de glicopeptideos é muito menor (63%) do que a StaI (88%). Assim, acredita-se que a StaK pode halogenar a posição 5 do heptaptídeo, que não é comum para os outros glicopeptídeos. No entanto, não existe qualquer evidência da especificidade das halogenases StaI e StaK, ou mesmo se as duas enzimas são necessárias para a halogenação do intermediário do A47934.
O emprego da técnica de biossíntese combinatorial pode gerar uma boa expectativa na descoberta de novos antibióticos, porém uma das limitações desse método é que o hospedeiro pode não expressar o fragmento de DNA incorporado, ou então, as vias metabólicas concorrentes podem desviar preciosos precursores. Outras dificuldades estão relacionadas à imprevisível especificidade do substrato, eficiência funcional das enzimas de produção, desconhecida especificidade do sistema de efluxo e o potencial de geração de compostos tóxicos incapazes de serem evitados (COATES; HU, 2007). Grandes esforços têm sido feitos no campo da descoberta de drogas, no entanto, a produção de novos compostos ainda é um grande desafio. A biossíntese combinatória é, sem dúvida, uma importante ferramenta a ser explorada para obtenção de produtos naturais.
Figura 12. Estrutura do antibiótico A 47934. Setas indicam catálise pelas halogenases
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2 Objetivos
Este trabalho teve como objetivo iniciar estudos funcionais e estruturais sobre halogeneses relacionadas com a produção de antibióticos.
Para isso, os objetivos específicos do trabalho foram:
- clonar, expressar e purificar 4 halogenases relacionadas com a biossíntese de antibióticos glicopeptídicos:
ComH, halogenase relacionada com a biossíntese da complestatina em Streptomyces lavendulae;
Orf8*, halogenase relacionada com a biossíntese de teicoplanina em Actinoplanes teichomyceticus;
StaK e StaI, halogenases relacionadas com a biossíntese do composto A49734 em Streptomyces toyocaensis;
-obter informações espectroscópicas e sobre o estado de oligomerização das amostras destas enzimas;
-realizar testes de cristalização para obtenção de estruturas tridimensionais; -realizar modelagem para obtenção de insights sobre suas especificidades; -realizar estudos funcionais preliminares para validação da função das mesmas.
Através de uma Bolsa de Estágio em Pesquisa no Exterior (BEPE), obter treinamento em técnicas de biologia molecular e genética de Streptomyces, associados à biossíntese combinatorial, realizando ensaios de complementação para halogenases StaK e StaI a fim de investigar a atuação destas em diferentes microrganismos produtores de glicopeptídeos:
-Amycolatopsis orientalis, produtor de vancomicina
-Actinoplanes teichomyceticus, produtor de teicoplamina
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