Busca genômica de proteínas de P vivax candidatas ao mimetismo molecular com proteínas de

A busca de proteínas de P. vivax candidatas ao mimetismo molecular com proteínas de hemácias humanas foi realizada em colaboração com o pós-doutor Rodrigo de Paula Baptista, do Laboratório de Imunologia e Genômica de Parasitos, Departamento de Parasitologia, ICB/UFMG.

A identificação das possíveis proteínas miméticas de P. vivax foi realizada por meio de genômica comparativa, utilizando-se seqüências do genoma disponíveis para P. vivax e o hospedeiro. Para essa análise, foi utilizada uma versão do pipeline local, em linguagem Perl, criado por LUDIN et al. (2011), e modificado para a identificação de todo o genoma de proteínas candidatas ao mimetismo molecular entre P. vivax e eritrócitos humanos (Figura 10).

Figura 10. Pipeline de mimetismo utilizado no presente estudo. *O mascaramento foi realizado

Neste pipeline, as sequências do proteoma do parasito foram divididas em fragmentos com sobreposição, e estes foram comparados, por meio de um alinhamento contra o proteoma humano, e tiveram seus hits mais próximos selecionados para a análise. É importante destacar que as sequências dos proteomas de P. vivax, de humanos e de eritrócitos humanos utilizadas neste estudo foram obtidas de bancos de dados públicos do uniprot.org e do ncbidbRBC. Os alinhamentos foram feitos utilizando-se o programa BLAST2.2.17 (ALTSCHUL et al., 1990). Durante todo o pipeline, etapas de filtragem para a remoção de proteínas conservadas de eucariotos redundantes para a nossa análise foram realizadas, por meio da ferramenta computacional blastp contra os proteomas de organismos eucariotos de vida livre não relacionados a P. vivax(C. elegans, C. intestinalis, T. adhaerens, S. pombe e A. thaliana). Seqüências com hits de e-value menores que 10-10 com qualquer uma das seqüências deste banco foram filtradas do nosso dataset. As proteínas restantes foram, então, submetidas ao programa de predição Phobius 1.01 (KALL et al., 2004), para o mascaramento de peptídeos sinais. Em seguida, as seqüências foram convertidas em uma série de fragmentos com sobreposição de tamanho 14 (quatorze resíduos), e os fragmentos que apresentaram similaridade com o banco de sequências de eucariotos de vida livre também foram removidos. Os fragmentos remanescentes foram submetidos a um BLAST contra o proteoma humano, e os hits similares foram mantidos como candidatos miméticos entre P. vivax e humano. Para tornar nossa análise ainda mais específica, selecionaram-se, dentre essas seqüências peptídicas, apenas as proteínas miméticas aos eritrócitos humanos, as quais foram consideradas os candidatos finais de nosso estudo.

4.14. Microscopia de desfocalização

Os experimentos envolvendo a técnica de microscopia de desfocalização foram realizados no Laboratório de Física de Sistemas Biológicos, no Departamento de Física da Universidade Federal de Minas Gerais, em colaboração com a Dra. Paula Magda da Silva Roma.

Para esses experimentos, foram utilizados dois microscópios invertidos operando em campo claro: o Nikon TE300, para mensurar o índice de refração da amostra, e, o Nikon TI-E Eclipse, para mensurar as medidas de contraste e flutuação do contraste. Ambos os microscópios foram utilizados com objetivas imersas em óleo (Nikon Plan APO DIC H,

100X, 1.4 NA Nikon Plan APO DIC H, 100X, 1.49 NA; Nikon, Melville, NY, EUA). As imagens das hemácias foram capturadas com uma câmera CMOS (CMOS, Silicon Video® 642M, Epix), utilizando-se uma taxa de captura fixada em 300 frames por segundo, por 10 segundos. Os filmes foram salvos em formato.tiff. A distância de desfocalização foi controlada por um deslocador piezoelétrico (P563 – 3CD, Physik Instrumente (PI) GmbH Co, Karlsruhe, Alemanha), acoplado ao estágio do microscópio. Esse instrumento possiblitou deslocamentos nanométricos nos eixos x, y e z, com relação ao seu plano suporte. Um sistema de controle de foco estável (PFS – Perfect Focus System) foi utilizado para manter a posição focal estável. Um filtro vermelho (λ = 0,61 µm) foi inserido na via óptica do microscópio para prevenir efeitos de absorção pelas hemácias.

Para o preparo da amostra, 0,5 µL de sangue fresco foi coletado de um indivíduo não infectado e ressuspendido em 1,5 mL tampão salina fosfato (PBS) (pH 7,4, NaCl 150 mM) com 1,0 mg/mL de albumina de soro bovino (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Essa solução tem um índice de refração de nsolução = 1,333±0,001 e representa uma solução isotônica (NaCl

0,9% - 300 mOsm/kg), conforme mensurado em um osmômetro (Advanced Model 3250 Single-Sample Osmometer). Após o preparo dessa solução, um volume de 490 µL dela foi transferida para um porta amostras e levada ao microscópio. Esse porta amostras é formado por uma lamínula de vidro previamente esterelizada, com espessura de 170 µm, onde se cola, utilizando-se graxa de silicone para alto-vácuo, uma cubeta de acrílico de diâmetro de cerca de 1,5 cm. As hemácias foram filmadas antes de se adicionar o anticorpo e, em seguida, adicionaram-se 10 µL de um dos dois anticorpos comerciais: o anticorpo monoclonal anti- banda 3 [IgG Anti-band 3 antibody clone EPR1426 (ab108414); abcam®], cujo imunógeno é um peptídeo sintético correspondente a alguns resíduos da banda 3 humana, ou, ainda, o anticorpo policlonal anti-hemácia [IgG Anti human red blood cell (RBC) antibody ABIN238043; antibodies online.com], cujo imunógeno consiste em hemácias humanas lavadas. Após trinta minutos de incubação, a 37ºC, as mesmas hemácias filmadas anteriormente foram filmadas novamente a fim de se avaliar possíveis alterações nas membranas.

Para a avaliação dos parâmetros geométricos, trabalhamos com 25 hemácias para o grupo controle (sem anticorpo) e 30 hemácias para cada grupo de anticorpo testado. Como referência, utilizamos as medidas de um eritrócito humano padrão: 6,2 a 8,2 µm de diâmetro; 2,0-2,5 µm de espessura no ponto mais espesso; volume médio em torno de 90 µm3 a 300

mOsmol/kg, podendo aumentar para 150 µm3 em uma forma esférica; superfície com cerca de 136 µm2.

Os parâmetros geométricos avaliados neste estudo foram o volume e o índice de esfericidade (índice k).

O índice k (Figura 11) representa a razão entre a espessura do centro (dc, onde c é centro) e a espessura na metade do raio (dr, onde r é o raio) e é utilizado para caracterizar a hemácia em: disco bicôncavo (k < 1), disco plano (k ~1) ou esferócito (k > 1), ou seja, reflete a forma da célula (Figura 11) (TISHKO et al., 2012).

Já para a avaliação da amplitude das flutuações em altura da membrana, filmamos oito hemácias antes e oito hemácias após a incubação com cada um dos anticorpos. Como a amplitude das flutuações em altura está ligada aos parâmetros elásticos da membrana da hemácia, quanto maiores forem os valores das flutuações medidas, mais flexível estará a célula e o inverso também é verdadeiro.

Figura 11. Determinação do índice k. dc é a espessura do centro da hemácia; dr é a metade do raio da