Células de Melanoma

Cultura de células de melanoma (B16F10) foram incubadas com CdTe-CdS e com os compósitos NQ9/CdTe-CdS e CQ0/CdTe-CdS afim de se observar possíveis interações em sítios celulares específicos. Estes sistemas foram analisados por microscopia de fluorescência. As células incubadas apenas com os PQs de CdTe-CdS apresentaram baixa biocompatibilidade com as células de melanoma, não exibindo fluorescência detectável, provavelmente devido a falta de afinidade entre as células de melanoma e os pontos quânticos de CdTe-CdS funcionalizados com acido mercaptoacético (AMA).

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Figura 4.69- Microscopia de fluorescência de células de Melanoma incubadas com NQ9/CdTe-CdS (Tempo de incubação: 30 min). Imagem (superior esquerda) da fluorescência, (superior direita) das células através de contraste de fase, e (inferior) das células marcadas em seu interior com NQ9/CdTe-CdS. As células estão na ordem de grandeza de 10 µm.

O sistema NQ9/CdTe-CdS funcionalizado com AMA parece apresentar um certo gradiente de permeabilidade, que resulta de diferentes níveis de interação QDs / penetração nas células estudadas. Percebe-se claramente que o compósito foi incorporado ao interior das células marcando alguma organela específica ou até mesmo o núcleo celular, o que pode representar uma ferramenta potencial para diagnóstico rápido (figuras 4.69 e 4.70).

Figura 4.70- Microscopia de fluorescência de células de Melanoma incubadas com NQ9/CdTe-CdS (Tempo de incubação: 30 min). Imagem (a) e (c) da fluorescência, e (b) e (d) das células sob contraste de fase. As células estão na ordem de grandeza de 10 µm.

O compósito CQ0/CdTe-CdS funcionalizado com AMA apresentou uma marcação (figura 4.71) menos intensa que a marcação com NQ9/CdTe-CdS.

(a)

(b)

(a)

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Figura 4.71- Microscopia de fluorescência de células de Melanoma incubadas com CQ0/CdTe-CdS (Tempo de incubação: 30 min). Imagem (superior esquerda) da fluorescência, (superior direita) das células sob contraste de fase, e (inferior) das células marcadas em seu interior com CQ0/CdTe-CdS. As células estão na ordem de grandeza de 10 µm.

O sistema CQ0/CdTe-CdS marcou o interior das células B16F10, porém estas mesmas células apresentaram-se com sua morfologia alterada.

Carreño-Gómez, et al, [112] relatam o efeito citotóxico de cloridrato de quitosana e micropartículas de quitosana dos quais a forma cloridrato de alta massa molecular apresentou maior bioatividade contra as células de melanoma B16F10. A elevada citotoxidade do cloridrato de quitosana com relação a células de melanoma B16F10 pode explicar o fato de algumas células terem se mostrado danificadas. Estudos complementares são necessários para se avaliar a biocompatibilidade e bioatividade dos sistemas utilizados contra células de melanoma B16F10.

5. CONCLUSÕES

Quitosanas com elevados valores de grau de desacetilação foram obtidas após a desacetilação, entretanto se constatou uma baixa influência do tempo reacional sobre o grau de desacetilação resultante;

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear de hidrogênio RMN 1H apresentou-se como uma ferramenta de alta sensibilidade na determinação do grau de desacetilação de quitosanas quando estas estão bem solubilizadas enquanto que a espectroscopia vibracional no infravermelho mostrou pouca eficiência na determinação quantitativa do GD provocada pela interferência dos sinais sobrepostos e pelo excesso de umidade da amostra;

A despolimerização da quitosana produziu fragmentos de massa molecular reduzida com relação à quitosana comercial permitindo que seus produtos fossem solubilizados em meio aquoso livre de traços de ácido favorecendo a aplicabilidade em meio biológico onde a influência do pH é determinante;

A cristalinidade e estabilidade térmica das quitosanas hidrolisadas foram diminuídas com relação ao seu precursor com alto grau de polimerização, pois a nova condição de baixa massa molecular desfavoreceu o ordenamento molecular, mas também favoreceu a degradação do polissacarídeo em condições de temperaturas 100°C mais baixas pela menor quantidade de ligações glicosídicas a serem quebradas;

O cloridrato de quitosana apresentou alto grau de cristalinidade apresentando padrões cristalinos completamente distintos da quitosana em sua forma neutra;

Adaptações no processo de reticulação polimérica utilizando íons tripolifosfatos conduziram à otimização na obtenção de partículas com diâmetros pequenos e alta carga superficial apesar de não ter sido alcançada ainda uma metodologia que permita a diminuição da dispersão de tamanho das partículas;

A estabilidade térmica das nanoquitosanas foi preservada com relação a seu precursor hidrolisado, no entanto houve uma diminuição no grau de hidratação concluindo-se que a reticulação induziu uma menor hidrofilicidade com relação à quitosana não reticulada;

117 As imagens de microscopia eletrônica de transmissão possibilitaram a visualização da morfologia irregular das partículas bem como a determinação do tamanho real das partículas formadas e constatou-se um desvio muito alto com relação aos diâmetros hidrodinâmicos obtidos por espalhamento hidrodinâmico de luz na suspensão coloidal das nanoquitosanas. Esse desvio é devido à alta capacidade de intumescimento da quitosana que em regime coloidal fica inchada apresentando-se na forma de nanogéis de quitosana;

A microscopia eletrônica de varredura apresentou a elevada rugosidade das partículas de quitosana favorecendo a adsorção de materiais para aplicações diversas, como a adsorção de drogas para uso da nanoquitosana como sistemas carreadores de fármacos, por exemplo;

A espectroscopia de absorção no UV-Vis apresentou um aumento gradativo da banda de plásmon em nanopartículas de ouro em 558 nm proporcional ao aumento do volume do sal de ouro utilizado na síntese indicando a formação de estruturas metálicas em regime nanométrico;

A formação de nanoestruturas metálicas provocou variações no diâmetro hidrodinâmico das novas partículas para valores mais elevados sugerindo a formação de uma casca metálica em torno do caroço polimérico. Essa suspeita foi visualizada através de microscopia eletrônica de transmissão onde partículas metálicas foram formadas com os mesmos formatos irregulares que os das nanoquitosanas utilizadas na síntese do compósito;

Com o aumento no volume para 200 μL de HAuCl4, o potencial zeta do novo material

assumiu valores negativos e grande parte das partículas de quitosana de carga positiva foram recobertas com a casca de ouro reduzido que tem carga superficial negativa assim como as partículas de ouro;

A síntese dos pontos quânticos de CdTe-CdS resultou em partículas monodispersas com diâmetro hidrodinamico médio de 1,22 nm, potencial zeta de -45,49 mV e forte fluorescência em 506 nm;

Os compósitos Quitosana/CdTe-CdS apresentaram uma discreta diminuição na intensidade de fluorescência e máximos de emissão deslocados de 506 nm para o CdTe-CdS para 536 nm, 545 nm e 567 nm, respectivamente, para os sistemas CQ0/CdTe-CdS, CQ3/CdTe-CdS e NQ9/CdTe-CdS. Esses deslocamentos apresentam-se como fortes indicativos de conjugação;

A marcação das células de Cândida Albicans (ATCC 90028) mostrou-se eficiente para marcação da parede celular do fungo quando o compósito CQ0/CdTe-CdS foi utilizado, não apresentando sinais de danos após a incubação. O compósito NQ9/CdTe-CdS não apresentou interação suficiente com as células do fungo, de forma a se obter uma marcação eficiente.

Os sistemas NQ9/CdTe-CdS e CQ0/CdTe-CdS foram incorporados às células de melanoma B16F10, sendo que o primeiro apresentou maior intensidade de fluorescência. Essas células apresentaram suas morfologias danificadas após o período de incubação com CQ0/CdTe-CdS perdendo, dessa forma, o controle na passagem dos fluidos do meio para seu interior e vice-versa de forma que a marcação celular pode ter se dado não por uma interação específica, mas sim pela passagem das partículas em células danificadas e sem padrão de seletividade, o que torna o resultado da marcação inconclusivo. Esses resultados podem ser indícios de uma atividade antineoplásica da quitosana.

Os resultados obtidos mostram que um simples procedimento de funcionalização e incubação de compósitos fluorescentes, com células fúngicas e neoplásicas pode representar uma ferramenta potencial para diagnóstico rápido e preciso alguns tipos de câncer bem como estudos dos mecanismos envolvidos.

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6. PERSPECTIVAS

Testar diferentes concentrações de base na reação de desacetilação para se verificar influência sobre o GD do produto desacetilado;

Encontrar uma metodologia que permita a diminuição da polidispersão das partículas poliméricas reticuladas com íons tripolifosfato;

Realizar testes de porosidade e área superficial específica das nanoquitosanas através da técnica BET;

Realizar medidas de difração de raios-x para verificação da cristalinidade tanto das nanoquitosanas quanto de seus compósitos metálico e semicondutores;

Evitar o fator de aglomeração dos compósitos metálicos e semicondutores;

Avaliação de mecanismos de biodegradabilidade das nanoquitosanas e seus compósitos como meio de viabilização de sua atuação in vivo como agentes terapêuticos e diagnósticos;

Estudar mais detalhadamente os processos biológicos fundamentais dos fungos Cândida Albicans e das células de melanoma para a compreensão da atividade biológica dos compósitos estudados através de MEV, MET e microscopia confocal; Realizar testes de toxicidade com as nanoquitosanas e seus compósitos com diferentes