C ITOTOXICIDADE E A TIVAÇÃO DOS M ACRÓFAGOS

Os macrófagos são células sensíveis, e responsáveis pela ativação de uma resposta inflamatória de forma que são muito usados em estudos de desenvolvimento de biomateriais. Após incubação dos macrófagos com o óxido de alumínio anodizado a citotoxicidade foi medida quantificando a atividade da LDH extracelular nos poços que continham a amostra com as células, as células sozinhas (o controlo mínimo) e as células danificadas propositadamente com Triton-X (controlo máximo). Para se efetuar os cálculos da percentagem de citotoxicidade, foram medidos os declives das curvas de absorvância para um comprimento de onda de 340nm durante 3 minutos (com registos de 10 em 10 segundos). Estas curvas foram obtidas através do equipamento Molecular Devices – SPECTRAmaxPlus 384 utilizando o software Softmax Pró 4.0. A tabela 9 apresenta os valores do declive de absorvância medidos em cada poço, bem como, os valores calculados de citotoxicidade e viabilidade.

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Tabela 9 – Valores médios medidos no espectrofotómetro para cada poço da placa

Amostras Dia Valor

Amostra Valor controlo mínimo Valor controlo máximo % Citotoxicidade % Viabilidade A12 1 3,9 7,6 33,2 14,6 84,4 2 4,2 9,2 96,8 5,7 94,3 3 16,3 13,5 57,0 6,3 93,7 4 20,8 16,0 65,2 9,8 90,2 A13 1 3,8 7,6 33,2 14,9 85,1 2 6,8 9,2 96,8 2,7 97,3 3 15,8 13,5 57,0 5,2 94,8 4 20,7 16,0 65,2 9,6 90,4

O valor de citotoxicidade das amostras analisadas foi calculado através da equação 17. Com o valor percentual da citotoxicidade obtém-se o valor percentual de viabilidade das amostras. Como mostra a figura 73 a viabilidade apresenta valores acima dos 84% em todos os dias amostrados sendo o segundo dia de cultura o que apresenta melhores valores, decrescendo ligeiramente no terceiro e quarto dia. Estes resultados revelam que as amostras A12 e A13 são adequadas ao crescimento dos macrófagos, mantendo as células viáveis até ao 4º dia.

1 2 3 4 0 20 40 60 80 100 90,4 90,2 94,8 93,7 97,3 94,3 Vi ab ili d ad e (%) Dia A12 A13 84,4 85,1

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Como os macrófagos são células iniciadoras de uma resposta inflamatória seria importante determinar se estas, estando viáveis, estariam a assinalar o material como estranho iniciando uma reposta inflamatória. O grau de ativação dos macrófagos foi medido utilizando um Kit ELISA para quantificação da citocina pró-inflamatória TNF-α. A imagem da figura 74 mostra a ativação dos macrófagos ao fim do primeiro e terceiro dias de incubação.

O valor percentual de ativação dos macrófagos é calculado da mesma forma que o valor percentual de citotoxidade, no entanto, para o controlo positivo (controlo máximo) utilizou-se o LPS, para provocar a máxima ativação dos macrófagos.

0 1 2 3 4 0 20 40 60 80 100 At iv aç ao (%) Dia A12 A13 15,1% 15,6% 9,8% 8,9%

Figura 74 – Gráfico da percentagem de TNF-α libertado pelos macrófagos sobre as amostras

Pela análise do gráfico da figura 74 é possível verificar que os macrófagos não detetaram as amostras como sendo estranho, uma vez que os valores são reduzidos, confirmando a biocompatibilidade do óxido de alumínio anodizado para o crescimento destas células.

5.7CRESCIMENTO CELULAR

O crescimento das células foi averiguado através da análise SEM nas amostras onde foram depositadas. A cultura de macrófagos fez-se sobre três amostras anodizadas nas mesmas condições (A1, A12 e A13). A figura 75 mostra micrografias com pouca ampliação (200x a 3750x) das amostras A1 e A13 de forma a visualizar a distribuição espacial das células.

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Figura 75 – Micrografias SEM da amostra A1 com células (a) 200x e (b) 2000x e da amostra A13 com células (c) 1000x e (d) 3750x

Em ambas as amostras a distribuição dos macrófagos não apresenta grandes diferenças e a adesão destas é visível, mesmo a em ampliações reduzidas. As células aderiram a todo o substrato e foram crescidas durante um período de cultura de 4 dias [18 e 72]. Na figura 76 a uma ampliação maior, a adesão das células à morfologia das amostras pode ser caracterizada com maior detalhe.

(a)

(b)

(c)

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Figura 76 – Micrografia SEM dos pseudópodes de uma célula a penetrar numa fissura presente na amostra (A13)

A uma ampliação maior é possível verificar as microvilosidades das células e a capacidade de penetração destas nas cavidades presentes na amostra. Através da figura 77 é possível observar os pseudópodes das células na zona porosa. Contudo, não é possível visualizar a penetração destes nos poros uma vez que estes apresentam um diâmetro superior (d = ~40nm) ao diâmetro dos poros existentes nesta amostra (D = ~20nm) [18].

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Este trabalho descreve a produção de membranas de óxido de alumínio anodizado, fabricado através do processo de anodização em duas etapas. Foi estudada a influência dos parâmetros do processo (potencial aplicado, temperatura e tempo de anodização) na morfologia dos poros criados. Na caracterização das membranas foram analisadas as propriedades morfológicas (SEM e AFM), propriedades de superfície (ângulo de contacto), propriedades estruturais (XRD) e propriedades óticas (Refletãncia).

As nanoestruturas de AAO produzidas foram utilizadas como template para o crescimento e

proliferação das células (macrófagos) onde os poros funcionaram como pontos de ancoragem para os pseudópodes das células. Para a visualização deste fenómeno recorreu-se à análise de SEM. Também foi testada a citotoxicidade da amostra e ativação dos macrófagos.

Após todas as análises e caracterizações, concluiu-se que:

- Em comparação com o estado da arte, com a utilização do processo de anodização em duas etapas e consequente otimização das condições de processamento foi possível produzir microcamadas de óxido de alumínio anodizado com estrutura nanoporosa uniformemente distribuída. De referir que, a partir da análise dos resultados concluiu-se que as condições ótimas de processo são: T=10ºC e U=17V.

- De acordo com a análise das propriedades estruturais efetuada foi possível concluir que a diminuição da temperatura do banho anódico influi consideravelmente na cristalinidade dos nanoporos de óxido de alumínio anodizado ou seja, a diminuição da temperatura do processo promove a formação de camadas porosas mais cristalinas.

- Nas amostras porosas, verificou-se o aumento do diâmetro de poro com a temperatura e pouca influência do potencial aplicado sobre esta dimensão.

- As propriedades óticas e de superfície (molhabilidade) relacionam-se e dependem das condições de processamento da anodização. O aumento da temperatura remeteu a valores de refletãncia superiores que por sua vez levaram a ângulos de contacto superiores devido à menor rugosidade superficial provocada pelos poros e que levaram ao efeito Cassie-Baxter.

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- Das experiências biológicas e de acordo com as medições de citotoxicidade e ativação dos macrófagos, as amostras em que se fez crescer as células, apresentaram uma resposta não citotóxica;

- Pela análise de SEM averiguou-se a adesão das células as amostras anodizadas, não através dos poros em si, mas através da nanoestrutura criada em cada amostra. No entanto, não foi possível verificar a total penetração dos pseudópodes dos macrófagos (D=40nm) nos poros da estrutura AAO (D=20nm) devido à reduzida dimensão destes. Para além disso, o efeito Cassie- Baxter também pode ter sido um motivo para não ocorrer a total penetração, uma vez que o meio de cultura das células (líquido) pode não ter entrado totalmente nos poros impedindo que os macrófagos cresçam para o interior dos mesmos.

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Neste trabalho não foi possível otimizar os parâmetros do processo de anodização, refletindo-se na formação de uma camada porosa pouco ordenada e com algumas imperfeições. No futuro, esta etapa deverá ser otimizada de forma a obter-se camadas porosas mais homogéneas e ordenadas (estrutura favo-de-mel).

A influência de vários pré-tratamentos (polimento mecânico, polimento eletroquímico, limpeza com diferentes reagentes químicos) deverá ser estudada com maior detalhe, uma vez que, esta etapa da anodização é crucial para a qualidade da estrutura nanoporosa final.

Na área da Biologia, seria vantajoso cultivar células em amostras fabricadas sob diferentes condições de processamento de forma a estudar a influência dos parâmetros anódicos na proliferação e adesão das células.

Finalmente, ensaios mecânicos (nano-indentação) poderão ser efetuados a fim de avaliar a dureza e resistência destes filmes de óxidos.

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