C ROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ULTRA PERFORMANCE (UPLC)

A cromatografia líquida (LC) consiste numa técnica de separação que utiliza uma fase móvel para separar os analitos que compõem uma determinada amostra através da sua migração diferencial ao longo de uma coluna cromatográfica, de acordo com os diferentes tipos de interações químicas e físicas dos analitos com as micropartículas que compõem o enchimento da coluna, designado por fase estacionária, e com a fase móvel. A maior ou menor retenção dos componentes da amostra depende da natureza do composto, da composição da fase estacionária e da fase móvel. O tempo que demora uma substância a ser eluída da coluna designa-se por tempo de retenção (TR), parâmetro característico de um composto para uma determinada fase móvel e estacionária, que é utilizado como critério de identificação. A fase móvel passa ao longo da coluna cromatográfica através da utilização de uma bomba de alta pressão. A utilização de pressão neste tipo de cromatografia aumenta a velocidade linear dos compostos e reduz a sua difusão dentro da coluna melhorando a resolução cromatográfica. Os solventes mais utilizados na composição da fase móvel, são: a água, o acetonitrilo e o metanol. A água, normalmente, contém tampões, ácidos ou bases, que ajudam na separação dos compostos. A eluição dos componentes da amostra da coluna pode ser realizada em condições isocráticas, ou seja, a composição da fase móvel não se altera durante o tempo em que decorre a análise, ou eluição em gradiente, situação em que existe a variação da composição da fase móvel. Através da otimização das condições de gradiente utilizadas, este tipo de eluição, normalmente, permite uma melhor separação dos componentes da amostra em função da diferença de afinidades das substâncias pela fase móvel versus fase estacionária.

Existem diferentes tipos de cromatografia líquida, dos quais se destacam, a cromatografia de fase normal (NP-HPLC, Normal Phase-High Performance Liquid Chromatography) e a

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cromatografia de fase reversa (RP-HPLC, Reverse Phase-High Performance Liquid

Chromatography). A NP-HPLC foi o primeiro tipo de sistema de HPLC utilizado na área da

química analítica e caracteriza-se por separar as substâncias de acordo com a sua polaridade. Esta técnica utiliza uma fase estacionária polar e uma fase móvel apolar, e é utilizada essencialmente quando a substância de interesse é muito polar. A força de ligação dos compostos à fase estacionária é tanto maior quanto maior a sua polaridade, aumentando o seu TR. A utilização de solventes mais polares na fase móvel diminui o TR dos compostos enquanto os solventes mais hidrofóbicos tendem a aumentar o seu TR. Na década de 1970, a NP-HPLC caiu em desuso, com o desenvolvimento da cromatografia de fase reversa, sendo esta, atualmente, o tipo de cromatografia mais vulgar e que foi utilizado neste trabalho.

Na RP-HPLC, vulgarmente designada simplesmente por HPLC, a fase estacionária é apolar e a fase móvel é de polaridade moderada. De entre as fases estacionárias mais comuns, destacam- se as formadas por partículas de sílica às quais se encontram ligadas cadeias alquilo C18 ou C8. Na RP-HPLC o TR é maior para moléculas de natureza apolar em comparação com as moléculas polares, que eluem mais rapidamente. O TR dos compostos aumenta com a adição de um solvente polar à fase móvel e diminui com a introdução de solventes mais hidrofóbicos. A seleção dos constituintes da fase móvel é muito importante. Normalmente, num sistema de fase reversa a fase móvel inclui um tampão aquoso e um solvente orgânico, preferencialmente, acetonitrilo ou metanol. O tampão aquoso deve ser volátil, especialmente no caso do LC-

MS/MS, preparado a partir de substâncias, como, por exemplo: o ácido fórmico, o ácido acético,

o acetato de amónio, a amónia e o formato de amónio, uma vez que a utilização de tampões aquosos não voláteis, como, por exemplo, tampões fosfato, precipitam na fonte de iões, provocando o seu entupimento e consequente degradação da performance do equipamento. Por outro lado, a utilização de tampões com elevadas concentrações deve ser evitado, de modo a

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prevenir a saturação da superfície das gotas formadas na interface do LC-MS/MS, com a consequente inibição da passagem dos analitos para a forma de um gás, conduzindo a uma diminuição da resposta analítica. Adicionalmente, é muito importante ajustar o pH da fase móvel, de modo a potenciar a ionização dos analitos de interesse, uma vez que a adição de uma pequena quantidade de um ácido volátil promove a ionização de compostos básicos, enquanto que a adição de uma base estimula a ionização dos compostos ácidos.

Na cromatografia, e de acordo com a equação de van Deemter, a eficiência aumenta com a utilização de partículas de menor diâmetro, porém a diminuição do tamanho das partículas do enchimento das colunas implica um aumento considerável da pressão exercida para promover a passagem da fase móvel através das colunas, sendo que a maioria dos sistemas de HPLC apenas podem operar até 400 bar. Por esse motivo, os sistemas convencionais apenas permitem a utilização de colunas com um diâmetro de partícula tipicamente entre 3 a 5 µm, de modo a manter níveis de pressão aceitáveis. Ao longo dos últimos anos a cromatografia líquida tem sofrido uma grande evolução. Em 2004, a empresa Waters Corporation lançou no mercado um novo tipo de sistema de cromatografia de alta pressão designado por UPLC (marca registada que significa, Ultra Performance Liquid Chromatography), equipamento este que foi desenvolvido com o objetivo de permitir o uso de fluxos e pressões mais elevadas (até 1000 bar), possibilitando a utilização de fases estacionárias com partículas de diâmetro < 2 µm, o que se reflete num maior poder de resolução, maior eficiência, sensibilidade e velocidade de análise, comparativamente com os tradicionais sistemas de HPLC.

1.2.2. INTERFACE (ESI–ELECTROSPRAY IONIZATION)

Para que os analitos possam ser introduzidos no espectrómetro de massa/massa, que se encontra sob alto vácuo, têm de ser previamente ionizados e o solvente proveniente do sistema de UPLC

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deve ser eliminado. Este processo tem lugar na interface. Os tipos de interface mais comuns são: a APCI (Atmospheric Pressure Chemical ionization) e a ESI (Electrospray Ionization), sendo que este último é o tipo de ionização mais utilizado, nomeadamente, na área da toxicologia forense e para a análise das substâncias incluídas neste estudo. Na ESI, o eluente proveniente do cromatógrafo entra na sonda através de um capilar metálico ao qual é aplicado uma alta voltagem (tipicamente entre 1 a 5 Kv), que leva à produção de um aerosol fino formado por gotículas carregadas de cargas elétricas, as quais saem da sonda ESI. Para auxiliar na evaporação do solvente, e consequente formação dos analitos sob a forma de um gás ionizado, é aplicado co-axialmente um gás de dessolvatação (o azoto) a uma determinada temperatura (normalmente, entre 350 a 450ºC). À medida que o solvente evapora, o tamanho das gotículas diminui, e a repulsão eletroestática entre as cargas aumenta. O solvente evapora até que a tensão superficial das gotículas atinja o denominado limite de Rayleigh. Neste ponto, as gotículas começam a deformar-se à medida que a repulsão eletroestática das cargas, nas gotículas progressivamente de menor tamanho, fica mais forte do que a tensão superficial que as mantém intactas. Nesta altura, as gotículas sofrem a denominada fissão de Coulomb, que consiste na sua “explosão” formando outras de menor tamanho. As novas gotículas são, sucessivamente, submetidas de novo ao processo de dessolvatação e fissão de Coulomb, formando-se progressivamente gotículas cada vez mais pequenas, até se obter um gás formado pelos analitos ionizados, que são atraídos para a entrada do espectrómetro de massa devido à alta tensão de carga oposta aplicada à entrada do analisador de massas. (figura 4)

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Figura 4 – Representação esquemática do processo de ionização por Electrospray (ESI).

A ESI é considerada uma técnica de ionização suave, uma vez que se verifica uma fragmentação muito reduzida das moléculas na fonte de ionização. Os iões obtidos são essencialmente iões moleculares (ou mais corretamente, iões pseudo-moleculares), formados pela adição de um hidrogénio [M + H]+ oupela formação de um aducto com outro catião, como seja, por exemplo, o ião sódio [M + Na]+, ou pela remoção de um hidrogénio [M – H]-, dependendo se o tipo de ionização selecionado for a ionização positiva ou negativa, respetivamente. Se por um lado, esta característica pode ser uma vantagem, uma vez que se observa sempre o ião molecular correspondente aos analitos, por outro, obtém-se muito pouca informação estrutural a partir do espectro de massa formado apenas por um ião. Esta desvantagem é ultrapassada através da combinação com a espectrometria de massa em tandem (ESI-MS/MS).