Calibração da coluna de exclusão por tamanho e caracterização dos ácidos

A calibração da coluna de exclusão por tamanho foi realizada para estimar os pesos moleculares dos ácidos húmicos e fúlvicos extraídos da amostra de fertilizante orgânico e suas frações de tamanho de partícula, bem como de outras possíveis substâncias presentes nos extratos.

Na calibração, representada na Figura 23, pode ser observado que a linearidade obtida é satisfatória, com um coeficiente de determinação de 0,933. A SEC está entre as técnicas mais utilizadas para estimar pesos moleculares, juntamente com SDS-PAGE e espectrometria de massas, sendo uma opção menos laboriosa que a primeira e com menores custos que a segunda (SNYDER et al., 2011). Dentre as vantagens da SEC estão a alta recuperação cromatográfica, uma vez que não há interação química de solutos com a fase estacionária, e o uso de gradiente de fase móvel isocrático, que é muito mais conveniente (SNYDER et al., 2011). O volume morto encontrado, representado pela eluição de Blue Dextran foi de 6,7 minutos. Compostos que apresentarem tempos de retenção próximos a este são considerados como fora do intervalo de trabalho da coluna e apresentam peso molecular acima de 70 kDa.

Figura 23: Curva de calibração para SEC, correlacionando pesos moleculares e seus respectivos tempos de retenção, obtida para substâncias de diferentes pesos moleculares.

Os cromatogramas obtidos para os ácidos húmicos e fúlvicos isolados pelo procedimento recomendado pela IHSS, utilizando extrações em meio básico e ácido (Seção 3.3.4.3), juntamente com o cromatograma obtido pela injeção de padrão de lignina, estão apresentados na Figura 24. A lignina também foi uma substância avaliada por sua capacidade de complexação com metais e por estar presente nas possíveis matérias primas do fertilizante orgânico, participando do processo de formação dos ácidos húmicos e fúlvicos.

Aprotinina (6,5 kDa) Ribonuclease A (13,7 kDa) Anidrase Carbônica (29 kDa) Ovalbumina (43 kDa) Albumina (66,4 kDa) y = -0.021x + 4.876 R² = 0.933 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 8 18 28 38 48 58 lo g M W

Figura 24: Cromatogramas (detecção a 254 nm) obtidos para os ácidos húmicos (HA) e fúlvicos (FA) extraídos da amostra de fertilizante com o procedimento da IHSS, e de padrão de lignina.

Todas as soluções foram preparadas na concentração de 4 mg mL-1_{. O}

gráfico foi construído utilizando as medidas de absorbância normalizada, uma vez que os três compostos estudados apresentaram diferentes valores de absorbância para o comprimento de onda de 254 nm, selecionado para as medidas no detector do cromatógrafo.

É possível observar que, para as condições de separação utilizadas neste estudo, ácidos húmicos e fúlvicos apresentaram regiões de sobreposição de seus cromatogramas, entre 22,5 e 30 minutos. Apesar disso, é possível identificar os picos que representam cada um destes compostos sem a necessidade de tratamentos químicos ou matemáticos, como a análise de deconvolução utilizada por Laborda et al. (2008) que obtiveram uma resolução pior para a separação das duas substâncias. Desta forma, pode-se supor que os elementos possivelmente ligados a essas substâncias (ácidos húmicos ou lignina) e que forem identificados nesta

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 A b o sr b â n ci a n o rm a liz a d a

tempo de retenção (min)

região de tempo de retenção do cromatograma não seriam devidamente identificados como associados a um ou outro destes compostos.

É importante destacar que o processo de extração de ácidos húmicos e fúlvicos da amostra de fertilizante orgânico recomendado pela IHSS não pode ser utilizado para trazer informações sobre especiação elementar. O uso de condições drásticas de pH pode promover a interconversão de espécies, formação de hidróxidos insolúveis e ainda afetar a capacidade de complexação das substâncias húmicas, o que pode levar a resultados precipitados (SZPUNAR, 2000; TEMPLETON et al., 2000).

Com os cromatogramas obtidos, foi possível estimar o peso molecular das substâncias húmicas extraídas da amostra de fertilizante orgânico, sendo eles de 34

kDa para os ácidos húmicos e de 17 kDa para os ácidos fúlvicos, com tempos de

retenção característicos de 16 minutos e 31 minutos, respectivamente (Figura 24). Vale ressaltar que ácidos húmicos e fúlvicos não apresentam um peso molecular definido, e sim, um intervalo de pesos moleculares (STEVENSON, 1994). Técnicas como freezing-point depression (medida do abaixamento do ponto de congelamento de determinado solvente na presença de um soluto) e medida de pressão osmótica permitem o cálculo de uma média de peso molecular pela estimativa de moléculas em solução, enquanto que espalhamento de luz e sedimentação em ultracentrífuga geram resultados de média de peso molecular em função dos pesos moleculares dos componentes do material coloidal. Cada uma das técnicas pode gerar um resultado diferente, e ainda devem ser levadas em considerações as condições experimentais, como pH, força iônica e concentração, já que o estado de agregação das moléculas afeta o resultado obtido (STEVENSON, 1994).

Os cromatogramas que mostram os perfis moleculares (Figura 25) indicam a presença, principalmente, de ácidos húmicos ou lignina nos extratos de fertilizante orgânico, com sinais mais intensos conforme há o aumento do pH do meio extrator. Também é possível observar que os sinais são mais intensos para a fração de tamanho de partícula > 300 µm, indicando que em um meio menos humificado e com mais características orgânicas a extração ocorre em maior extensão que em um meio mais humificado e mais inorgânico. Também é possível observar picos de compostos que foram eluídos no tempo morto, indicando que há a presença de substâncias com peso molecular maior do que 70 kDa sendo extraídos. Os picos referentes aos ácidos fúlvicos não foram identificados, embora esta classe de compostos exista na amostra de fertilizante orgânico, como observado na Seção 4.3.2. Assim, pode-se pensar em duas possibilidades, sendo a primeira a menor absortividade molar dos ácidos fúlvicos frente aos ácidos húmicos para o comprimento de onda de 254 nm, como já discutido anteriormente, ou ainda a baixa eficiência de extração, indicando que estes compostos podem estar fortemente associados à matriz.

Figura 25: Cromatogramas (detecção a 254 nm) obtidos para os diferentes extratos, nas diferentes frações de tamanho de partícula