da LXA4 observados. Os animais foram injetados com o antagonista dos
receptores canabinóides CB1 SR141716A (1 mg/kg, i.p.), o antagonista
dos receptores ALX BOC-2 (10 g/kg, i.p.) ou solução controle (10% DMSO e 0,1% Tween80 em salina), seguido 55 min depois pela injeção de uma dose selecionada de LXA4 (1 pmol/ 5 µl) ou controle (etanol
0,5% em PBS) e 5 min depois avaliados no teste do campo aberto (locomoção), catalepsia, temperatura retal ou placa quente (nocicepção). Experimento 3: Confirmação da ausência de participação dos receptores ALX na catalepsia induzida pela LXA4 em camundongos. A
partir dos experimentos iniciais descritos nos itens acima, a catalepsia foi escolhida como parâmetro comportamental preditivo de atividade canabimimética para a realização de experimentos adicionais de farmacologia. Esta abordagem teve o intuito de evitar o uso desnecessário de animais na geração de dados que seriam, em grande parte, redundantes. Para confirmar a ausência de participação dos receptores ALX nos efeitos centrais da LXA4 investigados, o
experimento com o antagonista BOC-2 foi repetido, desta vez com injeção central conjunta deste antagonista e LXA4. Os animais foram
injetados com uma dose selecionada de LXA4 (1 pmol/ 2 µl, i.c.v.) ou
controle (etanol 0,5% em PBS), co-injetado com BOC-2 (1000 pmol/2 µl, i.c.v.) ou controle (PBS) e 5 min depois avaliados no teste da catalepsia.
Experimento 4: Confirmação da participação dos receptores CB1
na catalepsia induzida pela LXA4 em camundongos. Para confirmar a
participação dos receptores CB1 nos efeitos centrais da LXA4
investigados, utilizamos animais com deleção gênica para os receptores CB1 (CB1
-/-
) e seus respectivos controles (CB1 +\+
) como uma abordagem complementar à farmacológica. Inicialmente, realizamos uma curva- dose resposta de LXA4 (0,01 pmol – 1 pmol/ 5 µl, i.c.v.) em
camundongos C57Bl/6NCrl, repetindo o experimento 1 nesta linhagem, que foi utilizada como background para a geração dos camundongos CB1
-/-
. No experimento propriamente dito, os camundongos CB1 +\+
e CB1
-/-
foram injetados com uma dose selecionada de LXA4 (1 pmol/2 µl,
i.c.v.) ou controle (etanol 0,5% em PBS) e 5 min depois avaliados no teste da catalepsia.
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4.3.6.2 – Grupo 2: Em busca de um mecanismo de ação para os efeitos centrais da LXA4
Experimento 5: Ensaio competitivo de ligação contra [3H]SR141716A em membranas de cérebro total de camundongo. Como a LXA4 induziu efeitos centrais canabimiméticos, recorremos à técnica
de ensaio competitivo de ligação utilizando um antagonista canabinóide marcado radioativamente para investigar se a ligação a receptores CB1
poderia constituir um mecanismo de ação da LXA4 no sistema nervoso
central. Concentrações crescentes de LXA4 (1 nM – 10 µM) foram
incubadas com as membranas de cérebro de camundongo a 37 °C por 1 h na presença de 0,5 nM do antagonista canabinóide CB1 marcado
radioativamente [3H]SR141716A. Curvas controle foram realizadas com adição cumulativa das concentrações de etanol comparáveis às presentes nas soluções de LXA4 (máximo de 1%).
Experimento 6: Ensaio de inibição de contrações induzidas eletricamente em ducto deferente isolado de rato. Este experimento teve como objetivo investigar se a LXA4 poderia exercer efeito
canabimimético em uma preparação in vitro funcional e sensível à ação de canabinóides. Concentrações cumulativas crescentes de LXA4 (1 nM
– 1 µM) foram adicionadas ao banho do ducto deferente isolado de rato. As contrações induzidas eletricamente após a adição de cada concentração de LXA4 foram comparadas à contração máxima, induzida
na ausência de droga. Curvas controle foram realizadas com adição cumulativa das concentrações de etanol comparáveis às presentes nas soluções de LXA4 (máximo de 1%).
Experimento 7: Interação da LXA4 com os endocanabinóides
AEA e 2-AG no teste da catalepsia em camundongos. Como a LXA4
aparentemente não age diretamente como um agonista dos receptores canabinóides CB1, procedemos à caracterização de seu mecanismo de
ação investigando se há interação entre seus efeitos e o de doses sub- efetivas dos endocanabinóides mais estudados, a AEA e o 2-AG. Inicialmente realizamos curvas dose-resposta de ambos os endocanabinóides no teste da catalepsia. Os animais foram injetados com AEA (10 – 200 pmol/ 2 µl, i.c.v.) ou controle (etanol 0,5% em PBS), com 2-AG (1 – 100 pmol/ 2 µl, i.c.v.) ou controle (acetonitrila 0,5% em PBS) e 5 min depois avaliados no teste da catalepsia. Definidas as curvas dose-resposta para cada um dos endocanabinóides, os animais foram co-injetados com uma dose sub-efetiva de LXA4 (0,01
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efetiva de AEA (10 pmol/ 2 µl, i.c.v.) ou 2-AG (10 pmol/ 2 µl, i.c.v.) ou o respectivo controle e 5 min depois avaliados no teste da catalepsia.Experimento 8: Ensaio de atividade das enzimas de degradação de endocanabinóides. Com o objetivo de determinar se os efeitos canabimiméticos da LXA4 poderiam ocorrer por interferência no
metabolismo de endocanabinóides, investigamos os efeitos da LXA4 na
atividade das enzimas de degradação de endocanabinóides mais conhecidas. A FAAH é considerada a principal enzima de degradação da AEA e a MAGL a principal enzima de degradação do 2-AG. A LXA4
(até 10 µM) foi incubada com amostras de fração citosólica ou membranar de cérebro total de camundongos para avaliação da capacidade de degradação de AEA ou 2-AG marcados radioativamente. A atividade enzimática da FAAH e da MAGL foi determinada respectivamente pela geração de metabólitos radioativos da AEA e do 2- AG no sobrenadante.
Experimento 9: Quantificação dos níveis de endocanabinóides no cérebro de camundongos após administração de LXA4. A fim de
determinar se os efeitos canabimiméticos da LXA4 poderiam ocorrer por
interferência nos sistemas de regulação dos níveis de endocanabinóides, investigamos os efeitos da LXA4 nos níveis dos endocanabinóides AEA
e 2-AG no cérebro de camundongos. Os animais foram injetados com uma dose efetiva de LXA4 (1 pmol/ 2 µl, i.c.v.) ou controle (etanol 0,5%
em PBS) e 5 min depois sacrificados para coleta do cérebro e dissecação a fresco do hipocampo, córtex e cerebelo para quantificação dos endocanabinóides nestas estruturas cerebrais por HPLC.
Experimento 10: Investigação dos efeitos combinados de LXA4 e
AEA no ensaio competitivo de ligação contra [3H]SR141716A em membranas de cérebro total de camundongo. Apesar dos evidentes efeitos comportamentais da LXA4 nos animais, quando administradas
isoladamente ou em combinação com a AEA, não conseguimos identificar seu mecanismo de ação utilizando o ensaio de ligação competitivo, avaliando a atividade das enzimas de degradação ou os níveis de endocanabinóides no cérebro após a injeção i.c.v. de LXA4 nos
camundongos. Então decidimos investigar se a LXA4 poderia cooperar
com a AEA de modo a facilitar a sua ligação nos receptores canabinóides CB1. O ensaio de ligação competitivo foi então realizado
novamente, testando a capacidade da LXA4 em alterar a curva
concentração-resposta da inibição da ligação do [3H]SR141716A pela AEA. A AEA (1 nM – 10 µM) foi incubada com 0,5 nM de
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[3H]SR141716A em membranas de cérebro de camundongos na presença e na ausência de LXA4 (100 nM).
Experimento 11: Investigação dos efeitos combinados de LXA4 e
AEA no ensaio de inibição de contrações induzidas eletricamente em ducto deferente isolado de rato. Para confirmar in vitro se a LXA4
poderia cooperar funcionalmente com a AEA em um ensaio sensível à ativação de receptores canabinóides CB1, o ensaio de inibição de
contrações neurogênicas do ducto deferente foi então realizado novamente, testando a capacidade da LXA4 em alterar a curva
concentração-resposta da inibição de contração induzida pela AEA. Concentrações cumulativas crescentes de AEA (1 nM – 10 µM) na presença e na ausência de LXA4 (100 nM) foram adicionadas ao banho
do ducto deferente isolado de rato. Uma curva similar foi realizada com o agonista canabinóide WIN55212-2 (10 nM – 1 µM) na presença e na ausência de LXA4 (100 nM). As contrações induzidas eletricamente
após a adição de cada concentração das drogas foram comparadas à contração máxima, induzida na ausência de droga. Curvas controle foram realizadas com adição cumulativa das concentrações de etanol comparáveis às presentes nas soluções testadas (máximo de 1%). 4.3.6.3 – Grupo 3: Possível relevância fisiológica da interação entre derivados da lipoxigenase e endocanabinóides no sistema nervoso central.
Experimento 12: Quantificação dos níveis de LXA4 no cérebro de
camundongos. Em função das limitadas informações a respeito da LXA4
no SNC o primeiro passo para definirmos se os efeitos centrais da LXA4
têm alguma relevância fisiológica foi determinar se a mesma é encontrada no cérebro em condições basais. Cérebros de camundongos foram coletados a fresco para dissecação do hipocampo, córtex e cerebelo e determinação dos níveis de LXA4 nestas estruturas cerebrais
por meio de ensaio de ELISA.
Experimento 13: Quantificação dos níveis de receptores ALX no cérebro de camundongos. Com o objetivo de identificar se os receptores ALX são expressos no cérebro, realizamos a imunodetecção de proteínas por Western blot em três regiões cerebrais onde quantificamos os endocanabinóides e a LXA4. Cérebros de camundongos foram
coletados a fresco para dissecação do hipocampo, córtex e cerebelo e determinação dos níveis de receptores ALX. O baço dos mesmos camundongos também foi dissecado a fresco e submetido aos mesmos