AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA E ATIVIDADE LAXANTE DO EXTRATO METANÓLICO BRUTO DAS FOLHAS DE Senna siamea (Lam.)
1. INTRODUÇÃO
A utilização das plantas medicinais com finalidades terapêuticas e profiláticas para várias doenças é uma das práticas médicas mais antigas. O conhecimento a respeito de seus usos vem sendo transmitido desde o início da civilização até os dias de hoje (CARVALHO, 2011; VEIGA JR et al., 2005).
Apesar das plantas possuírem efeitos curativos que são conhecidos popularmente, o ser humano desconhece o fato de que elas podem apresentar toxicidade tanto para o homem quanto para os animais, por isso faz-se necessário à avaliação de seus efeitos tóxicos (MARTINS et al., 2012; RODRIGUES; et al, 2010). A compreensão do potencial toxicológico das plantas é dificultada, mediante o desconhecimento de todos os componentes químicos e as quantidades exatas no vegetal. Em geral, alguns compostos isolados, são farmacologicamente testados, no entanto não proporciona uma imagem completa do produto a base de plantas, porque normalmente vários componentes são responsáveis pelos efeitos terapêuticos. Estes compostos podem trabalhar em sinergismo, sendo inativos ou diminuindo o potencial farmacoterapêutico, quando testados isoladamente. Além disso, os metabólitos podem variar, dependendo da safra, origem do vegetal, processo de preparação, entre outros fatores (WALKER, 2004).
Espécies do gênero Senna são conhecidas pela sua utilização popular como laxativo e purgativo. Estudos farmacológicos de algumas espécies comprovaram propriedades antimicrobianas (SAMY et al, 2000), anti-inflamatória (CUELLAR et al, 2001), antifúngica (PALAMICHAMY; NAGARAGAN, 1991) e antimalárica (TONA et al, 1999).
S. occidentalis, S. obtusifolia, S. fistula, S. lindheimeriana, S. fasciculata, apresentou toxicidade em bovinos (SCHMITZ; DENTON, 1977).
Hepatotoxicidade grave, embora incomum, pode ser evidenciada após exposições a quantidades anormais de metabólitos tóxicos como glicosídeos de antraquinonas (senosideos) (VANDERPERREN et al., 2005). Segundo Van Gorkom et al. (1999), componentes químicos de espécies do gênero Senna, como a S. alexandrina pode ser carcinogênico em camundongos e ratos, e o uso crônico ou abusivo deste agente resultou em sintomas, tais como dor abdominal, náusea e diarréia crônica.
Entretanto, de acordo com Hietala et al. (1987), Senosideos são os principais metabólitos ativos de Senna e exibem uma toxicidade muito baixa em ratos.
A presença de antraquinonas no gênero Senna constitui um caráter quimiotaxonômico (FALKENBERG, 2007; RODRIGUES et al. 2009b). Várias espécies desse gênero são
comumente empregadas devido à ação laxativa das antraquinonas (BARBA et al., 1992; VIEGAS JUNIOR et al., 2006; FALKENBERG, 2007; LOMBARDO et al., 2009).
A utilização de várias espécies do gênero Senna, nas últimas décadas, promoveu maiores interesses na descoberta da ação toxicológica dos extratos, assim como de compostos purificados. Estudos relatam que alcalóides e antraquinonas, estão envolvidos no potencial tóxico apresentado por plantas desse gênero. Enquanto os compostos de antraquinonas são responsáveis pela atividade laxante dessas espécies.
Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a toxicidade aguda, assim, como a atividade laxante do extrato metanólico bruto das folhas (EMBF) de S. siamea (Lam.) e S. alata (L.) Roxb.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Local de Trabalho
O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Bioensaios para Pesquisa de Fármacos – LBPF, do Departamento de Antibióticos, na Universidade Federal de Pernambuco (UFPE).
2.2 Material botânico
As folhas de S. alata (L) Roxb. e S. siamea (Lam.), foram coletadas no Campus da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) e no Campus da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), respectivamente, em março de 2012.
As exsicatas foram depositadas no Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), sob números de tombamento 87.186 e 87.187, respectivamente.
2.3 Preparação dos extratos
A secagem das folhas foi realizada em estufa a 45ºC por 72h, e em seguida pulverizadas. A extração de componentes foi obtida por maceração durante sete dias, usando metanol (100g/L) como solvente. A solução resultante foi concentrada à pressão reduzida em evaporador rotativo (BUCHII-RE) a 40ºC.
2.4 Animais
Foram utilizados camundongos albinos Swiss (Mus musculus), machos, com pesos entre 25-35g e aproximadamente 60 dias de idade. Os animais foram mantidos em gaiolas de polipropileno, em condições controladas de iluminação (ciclo 12 horas claro/escuro), temperatura (22 ± 3º) e receberam água e ração ad libitum. O manuseio dos animais durante o experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da UFPE (Processo número 23076.036439/2012-34).
2.5 Toxicidade Aguda
Para a avalição deste ensaio foi empregada à metodologia recomendada pela Organisation for Economic Co-operation and Development, (OECD 2011), onde três camundongos receberam por via oral uma dose de 2.000 mg/kg dos EMBF de S. alata e S. siamea. Após a administração os animais foram observados continuamente por uma hora e depois a cada 24 horas durante 14 dias, para verificação de qualquer alteração comportamental, fisiológicas ou mortalidade. Os animais foram avaliados pelo método de screening hipocrático, que verificou o comprometimento do animal como: estado de consciência, disposição, atividade e coordenação do sistema motor e tônus muscular, atividade do sistema nervoso central e autônomo do animal. Ao final do experimento, os animais sobreviventes foram pesados e sacrificados.
Para análise histopatológica, foram obtidas amostras do fígado, rim e baço que depois de fixados em formol por 24 horas, foram mantidas em álcool etílico (70%), até a inclusão em parafina por meio da metodologia convencional. Cortes de 5 µm de espessura foram colhidos em lâminas sinalizadas, coradas com Hematoxilina e Eosina e então observados ao microscópio de luz.
2.6 Atividade Laxante
Neste teste foi utilizada a metodologia modificada de Rao et al., (1997). Após 12h de jejum sólido, com água ad libitum, os animais foram divididos em grupos (n = 6), nos quais foram administrados, por gavagem, 10 ml/kg de solução salina a 0,9% (veículo), 2mg/kg de Sulfato de atropina (controle negativo), 0,01 ml/g de óleo de rícino (controle positivo) e o extrato de S. alata, S. siamea (grupos tratados), nas doses de 65,2 mg/kg, 125 mg/kg e 250 mg/kg. Após 30 minutos, todos os animais receberam 0,1 mg/ml de carvão ativado em solução salina 0,9% (10 ml/kg – via oral). Decorrido 30 min, os animais foram eutanasiados em câmara de CO2. A cavidade abdominal foi aberta e a intestino delgado removido. Com
auxílio de uma régua milimetrada, o comprimento total do intestino delgado (piloro à válvula íleo-cecal) e a distância percorrida pelo carvão ativado (última porção que contenha pelo menos 1 cm contínuo do marcador) foram medidos e calculados a porcentagem do percurso do carvão em função do comprimento total do intestino.
2.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos como média ± SEM. As diferenças entre os grupos experimentais foram analisadas por análise unidirecional de variância (ANOVA) seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey post hoc para determinar o nível de significância. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software Graph Pad Prism ® 5.0. P valores menores que 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
3 RESULTADOS E DISCUSÃO
3.1 Toxicidade Aguda e determinação da DL50.
Durante a avaliação comportamental, os animais apresentaram reações semelhantes, das quais nos primeiros 30 minutos houve prevalência de agitação, movimentos de vibrissas, movimentos estereotipados e circulares, aumento da freqüência respiratória, tremores finos, postura em garra, irritabilidade, reação de fuga e piloereção, caracterizando reações excitatórias e estimulantes. Após esse período, foram observadas reações depressoras, tais como: abaixamento do trem posterior, prostração, alteração de macha e postura estática. Além dessas, também foram evidenciados coceira, diurese, excreção fecal e espasmo.
As reações de excitabilidade seguida por depressiva sugerem a redução da quantidade de neurotransmissores estimulantes liberados durante a fase excitatória (FAI et al., 2005).
Ao final dos 14 dias não foi observado nenhum óbito e nem mudanças comportamentais. Todos os grupos (controle e tratados) apresentaram ganho de peso, entretanto não houve diferença estatisticamente significativa entre eles.
De acordo com as normas estabelecidas pela OECD 423, o EBMF de S. alata e S. siamea apresentaram baixa toxicidade por via oral.
3.1.1 Análise macroscópica e histológica dos órgãos fígado, rins e baço.
A análise macroscópica dos órgãos, não evidenciou alterações quanto ao aspecto e coloração.
Fígado
A variação do peso do fígado, está demonstrado no gráfico 1, mediante análise do mesmo pode-se verificar que os animais tratados com EMBF de S. siamea, apresentaram aumento significativo do peso, quando comparado com o grupo controle. O mesmo foi não evidenciado para o grupo tratado com S. alata.
Na análise histológica do fígado (Fig.1), foram identificados nos grupos dos tratados com ambos os extratos, finas vacuolizações citoplasmáticas. Nos tratados com EMBF S. siamea intensa atividade mitótica dos hepatócitos. E nos tratados com EMBF S. alata, veia centrolobular congesta de sangue. Enquanto que o grupo controle apresentou veia centrolobular, hepatócitos e capilares sinusóides preservados. As alterações evidenciadas nos grupos tratados são indicativos de hepatotoxicidade aguda. A intensa atividade dos hepatócitos apresentada no tratado com S. siamea, pode explicar a hiperplasia hepática evidenciada na análise macroscópica.
0 1 2 3 4
Controle
S. alata
S. siamea
*
V
a
ri
a
ç
ã
o
d
e
P
e
s
o
(
g
)
-
F
íg
a
d
o
Gráfico 1: Variação do peso (g) do fígado dos animais dos grupos controle (SF 0,9%), EMBF Senna alata (2000mg/kg) e EMBF Senna
siamea (2000mg/kg) Colunas e barras verticais representam a
porcentagem de média e SEM, respectivamente. * variação estatisticamente significativa entre grupo tratado em relação ao grupo controle.
Rins
A avaliação da toxicidade renal está representada no gráfico 2 e na Fotomicrografia (Fig. 2) abaixo. Na análise macroscópica, o peso dos rins dos grupos tratados foram superiores, de forma estatisticamente significativa, quando comparado ao grupo controle (gráfico 2). Na análise histológica observaram-se congestos de sangue nos glomérulos renais, em ambos os tratados. Nesses grupos, não foram encontrados alterações nos espaços subcapsulares e túbulos coletores.
Figura 1: do fígado dos grupos
S. siamea (FS), controle (FC) e S. alata (FA) FS: Observa-se
veia centrolobular congesta de sangue (v) e finas vacuolizações citoplasmáticas nos hepatócitos (setas finas e
curvas). Presença de ducto
biliar (db) e capilares sinusóides preservados (setas retas finas). FC: observa-se veia centrolobular (v), hepatócitos (setas brancas curtas) e capilares sinusóides
(setas finas) preservados, respectivamente. FA:
Identifica-se veia centrolobular (v), intensa atividade mitótica nos hepatócitos (cabeças de
seta), discretas vacuolizações
no citoplasma dos hepatócitos (setas finas e curvas) e presença de capilares sinusóides (setas finas retas). H.E.: 400X.
O grupo controle apresentou glomérulos renais na cortical com espaços subcapsulares preservados e túbulos coletores sem alterações na região medular (Fig. 2). Mediante resultado histológico do rim para os grupos tratados, foi observado alterações a nível renal.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
Controle S. alata S. siamea
*
*
V a ri a ç ã o d e P e s o ( g ) - Ri mGráfico 2: Variação do peso (g) do rim dos animais dos grupos controle (SF 0,9%), EMBF Senna alata (2000mg/kg) e EMBF Senna
siamea (2000mg/kg) Colunas e barras verticais representam a
porcentagem de média e SEM, respectivamente. * variação estatisticamente significativa entre o grupo tratado em relação ao grupo controle.
Figura 2 - Fotomicrografias do rim dos animais tratados com EMBF de S. siamea (RS), controle (RC) e tratado com EMBF de S. alata (RA). RS: Observa-se presença de glomérulos renais e vaso sanguíneo congestos de sangue, espaços urinários conservados (G) e túbulos coletores também conservados na região medular do rim (estrelas). RC: nota-se glomérulos renais na cortical (G) com espaços subcapsulares preservados e túbulos coletores (estrelas) sem alterações na região medular. RA: observa-se tufos de capilares glomerulares congestos de sangue (G), com espaços subcapsulares ainda conservados. B) Túbulos coletores preservados (estrelas). H.E.: 400X.
Baço
De acordo com o gráfico 3, a variação do peso do baço não foi estatisticamente significativa entre os grupos tratados e controle. Na fotomicrografia do grupo tratado com EMBF S. alata, foi evidenciado a presença de nódulos linfáticos aumentados (ativado) na periferia e outros em forma variada no interior do órgão. Nos tratados com EMBF S. siamea, nota-se um conglomerado de nódulos linfáticos mais centralizados e alguns irregulares dispersos na periferia. O grupo controle apresentou nódulos linfáticos preservados na periferia e de forma agrupada no interior do órgão. Sendo o baço um órgão linfóide, o mesmo pode apresentar alteração na produção de células de defesa mediante diversos fatores que põe em rico a homeostasia do organismo. Conforme expresso nos resultados, alterações a nível histopatológico do órgão, foi evidenciado, caracterizando reações tóxicas aguda dos extratos.
. 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Controle S. alata S. siamea
V a ri a ç ã o d e P e s o ( g ) - Ba ç o
Gráfico 3: Variação do peso (g) do baço dos animais dos grupos controle
(SF 0,9%), EBMF Senna alata (2000mg/kg) e EBMF Senna siamea (2000mg/kg) Colunas e barras verticais representam a porcentagem de média e SEM, respectivamente. * variação estatisticamente significativa entre grupo tratado com relação ao grupo controle.
Figura 3 - Fotomicrografias do baço dos animais tratados com EMBF de S. siamea (BS), controle (BC) e tratado com EMBF de S. alata (BA). BS: Nota-se um conglomerado de nódulos linfáticos mais centralizados (setas retas) e alguns irregulares dispersos na periferia. BC: Observa-se presença de nódulos linfáticos preservados na periferia e de forma agrupada no interior do órgão linfóide (setas longas). BA: Observa-se presença de nódulo linfático aumentado (ativado) próximo à periferia e outros com forma variada no interior do órgão linfóide (setas longas).
H.E.: 100X.
Outras espécies do gênero Senna apresentaram perfil toxicológico semelhante ao encontrado no presente trabalho, tais como a S. alexandrina, fitoterápico comercializado e muito utilizado na terapia de constipação. Há relatos do envolvimento desta planta em casos de hepatite após a ingestão de doses elevadas. A lesão hepática retornou após novas exposições ao extrato de S. alexandrina. Hepatotoxicidade pode estar relacionado com alcalóides e senosídeos, os principais metabólitos da folha e fruto do gênero Senna. Senosídeos são metabolizadas no intestino para Antron, que tem uma estrutura química semelhante à dantron, uma substância conhecida por ser hepatotóxico (BEUIRS, et al. 1991; LARREY; PAGEAUX, 1991). Estudos conduzidos por Muyibi et al. (2000) indicaram certo nível de toxicidade no uso terapêutico S. occidentalis já que foram evidenciadas alterações hematológicas e histopatológicas em ratos tratados com extrato aquoso das folhas. Segundo alguns autores, as toxoalbuminas, os alcalóides, e as antraquinonas são considerados os possíveis responsáveis pela toxicidade das sementes da S. occidentalis (MOUSSU, 1925; KIM et al., 1971; KEAN et al., 1971). Uma pesquisa realizada por Nsonde-Ntandou, et al. (2010), mostrou que a administração dos extratos aquoso e alcoólico de S siamea não causou morte nos animais até a dose de 3000 mg/kg. No entanto, S. alata é suspeita de ser tóxica aos rins e, ainda, considerada abortiva (LORENZI, 2000; PLANTAMED, 2013).
Compostos nefrotóxicos podem chegar aos rins, devido ao mau funcionamento do fígado, e conseqüentemente causar dano ao órgão. Os indícios de toxicidade apresentado pelo baço, pode ser devido aos danos causados nos demais órgãos.
3.2 Atividade Laxante
No gráfico 4, está representado o efeito da atividade laxante dos grupos: controle (SF 0,9%), Atropina (controle negativo), óleo de rícino (controle positivo) e os tratados com EMBF de S. siamea (62,5mg/kg, 125mg/kg e 250mg/kg). Após análise, verifica-se semelhança de atividade entre os grupos de tratados, e entre os tratados e o grupo controle, não havendo diferença estatisticamente significativa entre eles. Entretanto foi identificada diferença significativa entre o grupo tratado e atropina, no qual este apresentou motilidade inferior aos extratos. Esse era um comportamento esperado, pois atropina é um agente antiespasmótico, que reduz a motilidade do intestino. Nos grupos que foi administrado óleo de rícino, este já comercializado com indicação laxativa, apresentou motilidade superior aos tratados. 0 20 40 60 80 Controle 62,5 125 250 S. siamea (mg/Kg) Atropina Óleo Rícino
+
#
+
#
#
+
P e rc u rs o d o c a rv ã o a ti v a d o ( % )O efeito da atividade laxante de S. alata está representado no gráfico 5. Os animais tratados com EMBF de S. alata, apresentaram comportamento semelhante aos tratados com S. siamea. Não foi evidenciado diferença significativa entre as diferentes doses do grupo tratado e entre o tratado e o grupo controle. Porém houve diferença estatisticamente significativa
Gráfico 4: Efeito laxativo do EMBF Senna siamea, utilizando óleo rícino (agente diarréico) e Atropina (agente constipante). Colunas e barras verticais representam a porcentagem de média e SEM, respectivamente. (#) variação estatisticamente significativa com o grupo atropina. (+) variação estatisticamente significativa com o grupo óleo rícino.
entre os grupos tratados (62,5mg/kg e 250mg/kg) e Atropina , e tratados e óleo de rícino. Nos quais, os tratados apresentaram atividade maior que a atropina e menor que o óleo rícino. O tratado S. alata (125mg/kg) diferentemente dos demais, apresentou comportamento semelhante ao controle negativo (atropina).
0 20 40 60 80 62,5 125 250 S. alata (mg/Kg)
Controle Atropina Óleo Rícino
+
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P e rc u rs o d o c a rv ã o a ti v a d o ( % )De acordo com Ahn et al. (1978), Nsonde-Ntandou et al. (2005), Kaur et al. (2006), a S. siamea é uma planta medicinal muito difundida e cultivada no sudeste da Ásia e da África sub-saariana. A casca do caule é tradicionalmente usada contra prisão de ventre, malária e associados doenças como a febre e icterícia. Thamlikitkul et al. (1990), associa a atividade laxante da S. alata, a composição química da mesma.
Compostos de antraquinonas são extraídos a partir de folhas secas e vagens de Cassia angustifolia Vah. Esse metabólito é amplamente utilizado como laxante (LAITINEN, 2007).
Conforme demonstrado na literatura, várias espécies do gênero Senna apresentam atividade laxante associada ao composto antraquinona. Embora antraquinonas tenham sido identificadas na caracterização fitoquimica dos EMBF da S. alata e S. siamea, não foi evidenciado atividade laxante. O resultado obtido pelo presente estudo não está de acordo
Gráfico 5: Efeito laxativo do EMBF Senna alata, utilizando óleo rícino (agente diarréico) e Atropina (agente constipante). Colunas e barras verticais representam a porcentagem de média e SEM, respectivamente. (#) variação estatisticamente significativa com o grupo atropina. (+) variação estatisticamente significativa com o grupo óleo rícino
com a literatura, podendo essa divergência de atividade está relacionada a concentração do metabólito na planta, podendo variar de acordo com local e mês do ano, assim como procedimento extrativo.
4 CONCLUSÃO
Embora os EMBF de S. siamea e S.alata, não tenham ocasionado óbito dos animais, sendo classificada como atóxica ou com baixa toxicidade, conforme preconiza a OECD 423, foram evidenciados indícios de toxicidade aguda em análise histopatológica dos órgãos: fígado, rim e baço. Os referidos extratos em estudo não demonstraram atividade laxante, mesmo apresentando na caracterização fitoquímica o principal composto responsável pela atividade, antraquinonas.
Os dados obtidos no presente trabalho nos fornecem um parâmetro para o estabelecimento de uma margem terapêutica segura, assim como possíveis atividades terapêuticas apresentada pelo material vegetal, mediante os compostos fitoquímicos identificados. Esses resultados nos permitem da continuidade a pesquisa, implantando novos protocolos experimentais com perspectivas de novos resultados sugestivos para a ampliação de atividades terapêuticas relevantes.
Tabela 1 - Sinais clínicos da toxicidade observada em camundongos albinos Swiss machos, tratados com dose 2000mg/kg do EBMF da Senna siamea e Senna alata, por via oral.
EFEITOS S. siamea 2000mg/kg S. alata 2000mg/kg Controle SF 0,9% Estimulantes Agitação 3 1 3
Aumento da freqüência respiratória 1 1 1
Convulsão Focal 0 1 1
Convulsão clônica 0 0 0
Ereção de cauda 1 0 0
Irritabilidade 0 0 0
Levantamento de trem posterior 0 0 0
Movimentos estereotipados 1 1 2 Movimentos circulares 1 1 2 Movimentos de vibrissas 1 1 3 Piloereção 1 1 1 Postura de ataque 3 3 3 Saltos 0 0 2 Tremores finos/grosseiros 1 1 0 Depressores
Abaixamento de trem posterior 0 1 1
Alteração de marcha 2 1 1
Diminuição da freqüência respiratória 0 0 0
Dispnéia 0 0 0 Prostração 0 1 0 Sonolência 0 0 0 Postura estática 0 1 0 Outros Agressividade 1 3 0 Cianose 0 0 0 Coceira 3 3 1 Contorções abdominais 0 0 0 Distensão abdominal 0 0 0 Diurese 0 1 1 Diarréia 0 0 0 Espasmos 1 1 1 Espasticidade 0 0 0 Excreção fecal 2 1 2 Reação de fuga 3 3 3 Refluxo 0 2 0