105 conídios.mL-1, o fungo C. rosea suprimiu quase que totalmente a esporulação do patógeno B. cinerea (gráfico 4).
Esc al a d e n ot as (c ol on iz aç ão fo lia r) 0 2 4 6 8 Clo n 10 5 + Bo trytis Clo n 10 5 Clo n 10 6 + Bo tryt is Clon 10 6 Água + Bo tryt is Água Tes tem unha Botr ytis Tes tesm unha Clo nost ach ys
Gráfico 4. Colonização de Clonostachys rosea e esporulação de Botrytis cinerea
em discos de folhas de morangueiro tratadas com Clonostachys rosea.
5 DISCUSSÃO
A produção em grande escala é necessária para viabilizar a utilização agrícola de um agente de controle biológico. Esse fato também é indispensável para Clonostachys rosea. Apesar de haver poucos relatos na literatura, Frier et al.(1999) (citado por VICCINI, 2004), observaram que tanto em fermentação líquida, quanto em fermentação sólida, a produção de conídios é abundante. No presente trabalho foi otimizado o meio de cultura líquido e as condições que favorecem a maior produção de conídios do fungo C. rosea.
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Um meio de cultura adequado também é considerado importantíssimo, para o sucesso da produção de conídios/esporos de diversos fungos em meio liquido e, sua composição deve sempre conter fontes de carbono, nitrogênio e minerais (ALVES, 1998). No meio estudado no presente trabalho, foram testadas duas fontes de carbono, para a escolha da que incrementasse a produção de conídios de C. rosea. As fontes de carbono utilizadas foram a dextrose/glicose e a sacarose. Os resultados demonstraram que, a dextrose obteve melhor desempenho para a produção de conídios, tendo seu máximo de produção em 1,49x107 conídios mL-1, enquanto com sacarose foi de 7,30x106 conídios mL-1, um incremento de 48,99%. Thomas et al. (1987) testaram diferentes fontes de carbono e verificaram que o uso da glicose, aumentou a produção de conídios do fungo entomopatogênico
Beauveria bassiana em meio liquido.
Para a realização dos nossos testes, foi usada a metodologia de planejamento de experimentos, uma excelente ferramenta estatística que permite avaliar a interferência das variáveis em todo o processo e as interações entre as mesmas, além de reduzir substancialmente o número de ensaios e os custos durante todo o experimento (Rodrigues & Iemma, 2009). Durante o delineamento composto central, foi otimizado as condições de cultivo do C. rosea. Foi observado durante esse delineamento que o pH foi a variável que teve maior influência em todo o processo, pois com os valores 3,71 e 4,0 foram obtidos os melhores resultados e, na faixa de 2 e 2,3, mais ácida, a produção de conídios foi quase nula, contrário à relatos feitos por Sun et.al. (2013), que observaram a maior a produção de conídios de C.
rosea em faixas de pH mais neutras..
Os resultados também demonstraram que o fungo C. rosea não é tão dependente de iluminação para sua reprodução e multiplicação, pois com apenas 4 horas a produção foi de 1,22 x107conídios mL-1, próxima a de maior valor, que tinha como fotoperíodo 12 horas de luz (1,78x107 conídios mL-1). Testes de viabilidade por microgotas foram realizados e os resultados
mostraram que o crescimento do fungo Clonostachys rosea em meio liquido não interfere nas taxas de germinação, ficando sempre acima dos 90%
Leite et al. (2003) relataram que meios ricos em carbono e com deficiência em nitrogênio, tendem a produzir maior quantidade de conídios para os fungos entomopatogênicos, Beauveria brassiana e Metarhizium
anisopliae. No presente trabalho, estatisticamente a relação entre as
dosagens de carbono e nitrogênio não foram consideradas significativas durante o delineamento P & B 12, mas foi observado que o melhor resultado na produção de conídios foi a de 200:1 ( duzentas partes de carbono e uma de nitrogênio), concordando com o relatado pelo autor.
Relatos na literatura, descrevem sobre a importância do glicerol na produção massal de fungos agentes de biocontrole (HALLSWORTH & MAGAN, 1995; JIN et al. 1996 e SRIRAM et al., 2011). Watanabe et al. (2006) testaram a tolerância dos propágulos de Trichoderma asperellum a dessecação e, observaram que os produzidos em fermentação sólida apresentaram maior tolerância a dessecação em relação aos produzidos em meio liquido. Sriram et al. (2011) afirmaram que o uso do glicerol, mesmo diminuindo atividade da água no meio, aumentou o tempo de prateleira de formulações à base de Trichoderma harzianium. Em nossos estudos a adição do glicerol no meio de cultura foi considerada não significativa estatisticamente e, apresentou efeito negativo na produção de conídios de C.
rosea, apenas aumentando os valores de biomassa seca nos tratamentos com
seu uso. Esses estudos poderão ser feitos ou adaptados futuramente, sugerindo seu uso nas etapas de formulação..
O uso de biorreatores modernos possibilitam o controle de diversos parâmetros em todo o processo, como: temperatura, pH, agitação, pressão, oxigênio dissolvido e aeração. Jakubíková et al. (2006) relataram que a aeração é um dos fatores críticos em fermentadores para a produção de conídios, observando também a necessidade de suplementação com oxigênio para a manutenção de níveis requeridos. Nos ensaios realizados no presente trabalho, pH e agitação, não foram passíveis de controle, e as formas de
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manter algum nível de aeração foi através da proporção de meio de cultura/volume nos erlenmeyers (2,5:1) e agitação (160 rpm).Nos testes para validação dos resultados em biorreator, valores diferentes dos testes preliminares foram observados. O pH das amostras foram medidos após os 7 dias e, foi observado um valor de 7,73, muito acima do valor inicial ajustado (4,0). Esse valor demonstra o porquê do decréscimo nos valores de concentração de conídios e acréscimo na biomassa, pois nos testes preliminares foi demonstrado a grande influência da variável pH em todo o processo, e que com o aumento do pH, favorece menores valores na produção de conídios e um aumento na biomassa
A produção do fungo C.rosea em biorreatores, não afetou sua capacidade de colonização e de antagonismo a B.cinerea. em discos de morangueiro. Mesmo com sua aplicação em diferentes concentrações, a presença de B.cinerea foi praticamente nula, indo de encontro com a literatura, onde diferentes isolados de C.rosea, foram eficientes na supressão à esporulação do B. cinerea em folhas de roseiras e morango (Valdebenito et al., 1997).Nobre et al.(2005), relataram que o mecanismo de competição por nutrientes é oprincipal mecanismo de antagonismo de C. rosea a B. cinerea, em tecidos de folhas senescentes.
Sun et al. (2013) estudaram a produção de clamidósporos de C.
rosea em meio liquido. Esses autores verificaram uma produção de 1x108
clamidósporos mL-1, valores superiores aos registrados em nosso trabalho, que foi focado na produção de conídios, demonstrando ser preciso a continuidade dos estudos, buscando novas fontes de nutrientes e parâmetros que possam influenciar no aumento da produção de conídios do fungo
6 CONCLUSÕES
A produção de conídios do fungo Clonostachys rosea em meio liquido é possível.
A variável pH é a que tem maior influência em todo o processo de produção. A máxima produção de conídios foi, nas condições de pH 4,0 e 12 horas de luz.
Os conídios de C. rosea produzidos em meio liquido apresentam altos índices de germinação.
A produção em meio líquido não afetou a capacidade antagônica do C. rosea à Botrytis cinera.
A fonte de carbono dextrose incrementa a produção de conídios em comparação a sacarose.
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