7 DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE ANTI-OXIDANTE FRENTE AO RADICAL 2, 2–DIFENIL-1-PICRIHIDRAZILA (DPPH)
7.1 MATERIAIS
Clorofórmio (Sigma-Aldrich® – EUA – Lote: SHBB1474V); BHT (Alpha Química® – Brasil - Lote: 397MTG2110); DPPH (Sigma Aldrich® – Alemanha - Lote: STBB0719); etanol (Química moderna® – Brasil – Lote: 171); óleo de gergelim (Pazze® – Brasil – Lote: 471454); óleo de cártamo (Pazze® – Brasil – Lote: 710191); triglicerídeo dos ácidos caprico/caprílico (Delaware® - distribuidora – Lote: 050511); óleo de linhaça dourada (Pazze® – Brasil – Lote: 4700632); óleo de fígado de bacalhau (All Chemistry do Brasil®- distribuidora – Noruega – Lote: 42683); Dimetilsulfóxido (Sigma Aldrich® – França - Lote: SZBB1040V)tampão fosfato de potássio monobásico (Sigma Aldrich® – Alemanha - Lote: SZBA3560V).
7.2 DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE ANTI-OXIDANTE DO RADICAL DPPH
7.2.1 Preparação da amostra
Para a avaliação da capacidade antioxidante dos óleos foi utilizado o método colorimétrico do DPPH (2,2-difenil-1-picrihidrazila), segundo Choi e colaboradores (2002). Preparou-se uma solução-mãe do óleo a 10% (v/v), em clorofórmio, e diluiu-se até as concentrações de 0,3%, 0,6%, 1,2%, 1,6%; 2,5% e 3% (v/v), em etanol. O ensaio foi realizado em triplicata.
Preparou-se uma solução-mãe do BHT a 10% (p/v), em clorofórmio, e diluiu-se até as concentrações de 0,3%, 0,6%, 1,2%, 1,6%; 2,5% e 3% (v/v), em etanol. O ensaio foi realizado em triplicata.
7.2.3 Procedimento
Transferiu-se para tubos de ensaio 2,5 mL de cada uma das concentrações das amostras e do padrão e adicionou-se 1,5 mL de DPPH. As amostras e o padrão foram armazenadas ao abrigo da luz, por 30 minutos e as absorbâncias das mesmas determinadas por espectrofotometria na região do visível (518 nm). Simultaneamente preparou-se um branco, para cada uma das concentrações, adicionando-se 2,5 mL da amostra e 1,5 mL de etanol. Para o controle negativo, transferiu-se 2,5 mL de etanol e 1 mL do DPPH. A leitura do controle deve ficar na faixa de 0,8 a 0,9.
7.2.4 Cálculo da porcentagem de inibição
A porcentagem de inibição do radical DPPH foi calculada através da equação 7.1, descrita a seguir:
( )
( )
Onde,
absorbância da amostra: absorbância da fração contendo o óleo; absorbância do branco: absorbância da fração contendo o óleo sem adição do DPPH; absorbância controle: absorbância da solução de DPPH em etanol.
7.2.5 Avaliação estatística
Os óleos e o BHT foram comparados por Análise de Variância (ANOVA) (p<0,05), seguida do teste de Tukey, para cada concentração de óleo utilizada.
7.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Existe uma variedade de métodos para se determinar a capacidade antioxidante de ativos presentes em alimentos, fluidos biológicos, vegetais, entre outros. A maioria dos métodos in vitro, tem como reagente um radical livre, o qual é capturado ou neutralizado pelos compostos antioxidantes, inibindo a formação de produtos de oxidação (ROGINSKY; LISSI, 2005). Devido aos diferentes tipos de radicais livres e de suas diferentes formas de atuação em organismos vivos, dificilmente existirá um método simples e universal pelo qual a atividade antioxidante possa ser medida precisa e quantitativamente (ALVES et al., 2010).
Segundo Roginsky e Lissi (2005) um dos métodos mais conhecidos para determinar a atividade antioxidante de extratos e substâncias isoladas é o método do DPPH. Por ação de um antioxidante o DPPH é reduzido formando difenil-picril-hidrazina, alterando a coloração apresentada para amarelo, reação essa monitorada pelo decréscimo da absorbância em 518 nm.
Originalmente, o ensaio utilizava metanol como solvente para o preparo do DPPH e das amostras, no entanto, como o metanol não dissolve óleos comestíveis foram necessárias adaptações para os compostos lipofílicos dos óleos vegetais, por meio da utilização de solventes apropriados para essas amostras. O ensaio do DPPH pode ser aplicado para classificar as amostras de óleo quanto à sua capacidade antioxidante, porém apenas de uma maneira qualitativa, já que essa atividade pode ser afetada pelo sinergismo destes compostos com as interfaces ar-óleo, ar-água e/ou óleo-água presentes no meio (CASTELO-BRANCO; TORRES, 2011).
A capacidade antioxidante dos óleos de gergelim, cártamo, triglicerídeos do ácido cáprico/caprílico, bacalhau e linhaça foi avaliada pelo método do DPPH e os dados estão apresentados nas tabelas 7.1 e 7.2 e representados graficamente na figura 7.1.
Tabela 7.1 – Capacidade sequestradora do radical DPPH dos óleos OTc, OCa e OGe.
Concentração do óleo (%)
OTc OCa OGe
CS*+ DP CS*+ DP CS*+ DP 0,3 1,05 + 0,37 10,96 + 0,55 23,87 + 0,67 0,6 1,13 + 0,50 19,38 + 1,06 33,21 + 0,70 1,2 1,25 + 0,28 30,78 + 0,93 48,02 + 0,19 1,6 1,29 + 0,18 44,30 + 0,12 58,82 + 0,55 2,5 1,21 + 0,24 67,31 + 0,69 76,09 + 0,24 3,0 1,49 + 0,25 72,82 + 0,64 85,84 + 0,67
*CS= capacidade seqüestradora do radical DPPH; DP = desvio padrão
Tabela 7.2 – Capacidade sequestradora do radical DPPH dos óleos e do BHT.
Concentração do óleo (%) OBa OLi BHT CS*+ DP CS*+ DP CS*+ DP 0,3 12,06 + 0,67 8,79 + 1,03 88,41 + 0,03 0,6 21,44 + 1,12 22,65 + 1,29 91,50 + 0,02 1,2 32,56 + 0,49 40,57 + 0,31 92,11 + 0,20 1,6 43,89 + 0,67 61,65 + 0,36 92,50 + 0,20 2,5 53,44 + 1,33 77,02 + 0,31 92,70 + 0,20 3,0 59,71 + 0,12 91,63 + 0,76 92,83 + 0,74
*CS= capacidade seqüestradora do radical DPPH; DP = desvio padrão
Os óleos vegetais constituem-se predominantemente por triacilgliceróis, frequentemente ricos em ácidos graxos poli-insaturados. Também estão presentes alguns lipídios formados durante o processamento, ácidos graxos livres, esteróis, tocoferóis, tocotrienóis, compostos fenólicos, pigmentos (carotenóides e clorofilas) e metais de transição como ferro e cobre (CHAIYASIT et al., 2007). Eles são a principal fonte de tocóis da alimentação, sendo os tocoferóis a principal forma de tocol encontrada na maioria dos óleos. Os tocóis constituem um grupo de moléculas que apresentam atividade de vitamina E. Existem nanatureza quatro formas (α, β, γ e δ) e são potentes antioxidantes lipofílicos. O α- e o γ-tocoferol são os mais encontrados nos óleos vegetais. Há evidências de que a capacidade antioxidante dos óleos vegetais pode ser influenciada pelo teor de tocóis totais, bem como
pela concentração de alguns tocoferóis individuais como γ- e δ-tocoferóis (SALDEEN; SALDEEN, 2005).
Figura 7.1 – Representação gráfica da capacidade seqüestradora do radical DPPH dos óleos e do BHT em diferentes concentrações, expressas em média + DP.
Os compostos fenólicos são metabólitos secundários das plantas, que exibem uma variedadede ações biológicas, especialmente devido a suas propriedades antioxidantes. Assim como ocorre para os tocóis, a atividade antioxidante varia sensivelmente entre os diferentes compostos fenólicos. Os fenólicos mais comumente detectados nos óleos vegetais fazem parte da classe dos ácidos fenólicos, especialmente os ácidos cafeico, vanílico, p-cumárico, siríngico, p-hidroxibenzoicos, além de oleuropeína, 3-hidroxifenil-etanol e 3,4dihidroxifenil- etanol (GUTFINGER, 1981). No entanto, em geral esses compostos são encontrados em baixas concentrações nos óleos refinados devido à sua baixa estabilidade ao processo de refino, comprovado após um estudo com o óleo de oliva, que apresentou redução de 50% na sua capacidade antioxidante, que foi associada com a redução dos compostos fenólicos totais, mas não com a redução de α-tocoferol. É possível que os óleos vegetais prensados a frio apresentem teores igualmente elevados de compostos fenólicos, os quais podem ter um papel determinante na sua capacidade antioxidante (CASTELO-BRANCO; TORRES, 2011; SZYDTOWSKA-CZERNIAKet al., 2008).
Os componentes lipídicos, especialmente os ácidos graxos, estão presentes nas mais diversas formas de vida, desempenhando importantes funções na estrutura das membranas celulares e nos processos metabólicos. Em humanos, os ácidos linoléico (ω 6) e linolênico (ω 3) são necessários para manter as membranas celulares, as funções cerebrais e a transmissão de impulsos nervosos. Esses ácidos graxos também participam da transferência do oxigênio atmosférico para o plasma sanguíneo, da síntese da hemoglobina e da divisão celular (YOUDIM; MARTINI; JOSEPH, 2000). Os ácidos graxos das famílias ω-6 e ω-3 são obtidos por meio da dieta ou produzidos pelo organismo a partir dos ácidos linoléico e linolênico, pela ação de enzimas alongase e dessaturase. As alongases atuam adicionando dois átomos de carbono à parte inicial da cadeia, e as dessaturases agem oxidando dois carbonos da cadeia, originando uma dupla ligação com a configuração cis (MARTINI et al., 2006).
A peroxidação lipídica envolve complexas reações radicalares autopropagantes, resultantes das interações químicas entre os ácidos graxos insaturados e espécies reativas de oxigênio que podem causar a perda de ácidos graxos essenciais (linoléico e linolênico) e dos antioxidantes naturais, além da produção de diversos compostos, com potenciais efeitos adversos à saúde humana, implicando diretamente na segurança dos óleos vegetais utilizados (CHOE; MIN, 2006).
O óleo de gergelim contém uma classe de compostos conhecidos como sesamim, sesamolim e uma pequena quantidade de sasamol, que são os principais compostos responsáveis por suas características antioxidantes (LEE; LEE; CHOE, 2008; WU, 2007). O óleo de cártamo é extraído do açafrão, planta rica em polifenóis e -tocoferol (CHO et al., 2011). O óleo de linhaça é um alimento de origem vegetal rico em ácidos graxos ω-3 e ω-6, ácido octadecenóico, além de um elevado teor de fibras, proteínas e compostos fenólicos
(BARROSO et al., 2014; GALVÃO et al., 2008; THOMPSON; CUNNANE, 2003).
De acordo com os dados apresentados nas tabelas 7.1 e 7.2, podemos observar que as melhores capacidades sequestradoras do radical DPPH foram obtidas com os óleos de linhaça, cártamo e gergelim, o que pode ser justificado pela composição dos mesmos, conforme descrito anteriormente. Para todos os óleos, com exceção dos triglicerídeos do ácido cáprico/caprílico, a capacidade sequestradora do radical DPPH foi dependente da dose, sendo que até a concentração utilizada, não foi verificado a formação de um platô (Figura 7.1).
Figura 7.2 – Análise estatística da capacidade sequestradora do radical DPPH dos óleos e do BHT em diferentes concentrações, expressas em média + DP.
Legenda: a:OCa; b:OTc; c:OGe; d:BHT; e:OBa f:OLi. Letras superiores indicam que existe diferença estatística (p< 0,05) na capacidade de sequestrar radicais de DPPH
Quando os valores médios da capacidade de sequestrar os radicais de DPPH dos óleos e do BHT foram comparados por ANOVA seguido de Tukey (p<0,05), verificamos que os somente o óleo de linhaça (OLi), na concentração de 3,0%, não apresentou diferença significativa em relação ao padrão (BHT). O óleo de gergelim (OGe) foi o que apresentou
maior atividade antioxidante nas concentrações de 0,3%, 0,6%, 1,2% e 2,5%, somente sendo inferior ao óleo de linhaça na concentração mais alta (Figura 7.2).
A capacidade antioxidante tem sido utilizada como indicador da bioatividade dos óleos vegetais no organismo humano. Através dos valores de capacidade antioxidante in vitro é possível ranquear os óleos vegetais quanto a seu potencial efeito benéfico no organismo humano. Entretanto, é razoável supor que a ação dos principais antioxidantes dietéticos de importância biológica in vivo dependa de fatores como, o nível de estresse oxidativo ao qual o organismo é exposto, a composição e as quantidades de antioxidantes e pró-oxidantes habitualmente ingeridos, assim como da biodisponibilidade e do metabolismo dos compostos antioxidantes no organismo humano (CASTELO-BRANCO; TORRES, 2009).
7.4 CONCLUSÕES
O método do DPPH se mostrou adequado para determinar a atividade antioxidante dos óleos vegetais e dos triglicerídeos do ácido cáprico/caprílico utilizados no presente estudo. A capacidade dos óleos em sequestrar os radicais livres do DPPH foi concentração
dependente, com exceção do Tc.
Os triglicerídeos do ácido cáprico/caprílico, não demonstraram capacidade de sequestrar os radicais livres do DPPH.
Somente o óleo de linhaça, na concentração de 3,0%, teve sua atividade antioxidante comparável a do BHT, quando avaliados por ANOVA seguido de Tukey (p <0,05).
O óleo de gergelim foi o que apresentou maior capacidade de sequestrar os radicais livres do DPPH nas concentrações de 0,3%, 0,6%, 1,2% e 2,5%, somente sendo inferior ao óleo de linhaça na concentração de 3,0%.