E. faecium e faecalis
3.3. Capacidade de adesão das cepas de E faecium e E faecalis
A capacidade de adesão em superfície de poliestireno foi avaliada para as 5 cepas de E. faecium e 5 cepas de E. faecalis com o objetivo de se comparar os diferentes perfis de virulência dessas cepas com o seu potencial de formação de biofilmes.
A Figura 1 apresenta os valores médios e barras de erro padrão das leituras de densidade óptica (DO540 nm) observadas para cada isolado ao longo do tempo.
Considerando-se o erro padrão das amostras, apenas 2 das 10 cepas possuíam potencial para a formação de biofilmes em todos os tempos avaliados neste estudo (6, 12, 24 e 48 horas): E. faecium C1E105, isolado do processamento de queijo de Coalho e E. faecalis F68, isolado do processamento de ricota. Considerando-se os parâmetros de densidade óptica estabelecidos por Sun; Sundsfjord; Song (2012) para Enterococcus spp, as duas cepas possuem características de adesão fraca (DO540 nm >0,06 a <0,3) ou moderada (DO540 nm >0,3 a <1,0).
A cepa E. faecalis F68 iniciou adesão fraca após 6 horas de incubação a 37ºC
(DO 540 nm média = 0,06), com aumento gradual da densidade óptica até o período de
24 horas de incubação (DO 540 nm média = 0,30), com perfil de adesão entre fraco e
moderado (Figura 1). Após 48 horas de incubação ocorreu a redução da capacidade de adesão dessa cepa, com valores médios de DO540nm = 0,06, não se diferindo da
incubação de 6 horas.
A adesão da cepa E. faecium C1E105 também iniciou o processo de adesão fraca após 6 horas de incubação (DO 540 nm média = 0,12), evoluindo para adesão
moderada após 24 horas de incubação (DO 540 nm média = 0,44). Com 48 horas de
incubação também ocorreu redução da capacidade de adesão dessa cepa, que não apresentou diferença de perfil de adesão do biofilme formado após 6 horas de incubação (DO 540 nm média = 0,11).
A redução da capacidade de adesão no biofilme de 48 horas pode ter sido promovida pelo aumento da densidade de células mortas nesse período, em virtude da redução da disponibilidade de nutrientes e produção de componentes que seriam tóxicos para as mesmas (BRANDÃO et al., 2010; JAVED et al., 2011; MADIGAN et al., 2010).
Na avaliação da cinética de crescimento por densidade óptica, observou-se que todas as cepas atingiram o crescimento máximo após 6 a 8 horas de incubação (dados não apresentados). Sabe-se que no período de crescimento exponencial ocorre a produção da maior parte dos compostos metabolizadas pelas células, os quais podem afetar na capacidade de adesão e taxa de crescimento da população microbiana (MADIGAN et al., 2010).
Enterococcus são bactérias ácido lácticas, portanto, podem reduzir o pH do meio, alterando as forças de atração entre o micro-organismo e a superfície, reduzindo, portanto, sua capacidade de adesão (ANDRADE, 2008; TEIXEIRA et al, 2005). Além disso, algumas cepas desse gênero são capazes de produzir peptídeos com atividade antimicrobiana, os quais podem ser letais também para a própria cepa que o produziu, acarretando na redução da sua densidade no biofilme (BRANDÃO et al., 2010; JAVED et al., 2011).
Figura 1: Capacidade de adesão das cepas de E. faecium e E. faecalis.
1Medias das DO540 nm e barras de erro padrão. DO540nm < 0,06 = não há formação de
biofilme; DO540nm > 0,06 a < 0,3 = adesão fraca; DO540nm > 0,3 a < 1,0 = adesão moderada; DO540nm > 1,0 = adesão forte.
C1E039 C1E065 C1E067 C1E087 C1E105 F068 F073 F116 F119 F130
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 6 horas12 horas 24 horas 48 horas ISOLADO (Enterococcus) D en si da de Ó pt ic a (5 40 n m ) 1
Um aspecto interessante avaliado neste estudo é que as duas cepas que apresentaram capacidade de adesão, são as mesmas que apresentaram maior resistência ao EEP e que se diferem das demais por possuírem algum gene plasmidial de resistência à vancomicina (vanA ou vanB).
Além disso, a maior capacidade de adesão foi detectada para a cepa E. faecium C1E 105 que também pode desenvolver mecanismos de resistência a altas concentrações de vancomicina e teicoplanina, devido à presença do gene vanA (COURVALIN, 2010) e não possui nenhum gene diretamente relacionado ao processo de adesão (ace, gelE, esp, efaA).
Ainda não há evidências que estabeleçam uma correlação direta entre o aumento da capacidade de adesão e a presença de mecanismos de resistência à vancomicina. Mas uma hipótese, seria a capacidade destas cepas de desenvolverem um mecanismo específico que impeça a ligação de glicopeptídeos, (como a vancomicina) com as enzimas relacionadas a produção dos peptidoglicanos da parede celular (COURVALIN, 2010).
O presente estudo também demonstrou que a presença de genes de adesão não necessariamente seja um fator determinante para o aumento da capacidade de adesão, uma vez que cepas que possuem genes de adesão não formaram biofilmes. Essa evidência corrobora com os resultados apresentados em outros estudos que mostraram que a presença de genes como os de proteína de superfície (esp) não estaria diretamente relacionada com a formação de biofilmes em superfície abiótica (ELHADIDY; ELSAYYAD, 2013; HEIKENS; BONTEN; WILLEMS, 2007). Estes apontam que outros mecanismos relacionados a mediação do sistema quorum sensing (QS) e a capacidade de produção de exopolissacarídeos (EPS) também podem influenciar neste processo.
Apesar de todas as cepas avaliadas neste estudo possuírem o gene luxS, os resultados apresentados neste estudo não são conclusivos para correlacionarem a possível produção de moléculas AI2 com a sua capacidade de adesão.
Uma hipótese, já evidenciada em outro estudo, indica que a correlação entre a resistência à vancomicina e a expressão do gene luxS pode estar relacionada ao aumento da capacidade de adesão de Enterococcus. Embora essa correlação não
seja completamente elucidada, Shao et al. (2012), comprovaram que cepas de E. faecalis resistentes à vancomicina possuem maior capacidade de adesão quando
Além disso, outras hipóteses também podem ter contribuído para a ausência da capacidade de adesão das demais cepas de E. faecium e E. faecalis, incluindo: características de hidrofobicidade de cada cepa, menor capacidade de produção de EPS, produção de compostos que afetaram a capacidade de adesão (como peptídeos antimicrobianos, por exemplo), produção de compostos que afetaram a expressão do gene luxS ou o processo de adesão relacionado a outro sistema de regulação do QS, como o operon fsr, por exemplo (ELHADIDY; ELSAYYAD, 2013; JAVED et al., 2011; TEIXEIRA et al, 2005; VENDEVILLE et al., 2005).
3.4. Influência dos extratos de própolis na capacidade de adesão de E. faecium e E. faecalis
Os extratos etanólico (EEP) e concentrado de própolis verde (ECP) foram testados contra as duas cepas que apresentaram alguma capacidade de adesão no biofilme controle (E. faecium C1E105 e E. faecalis F68). Utilizou-se o método do cristal violeta que tem como princípio geral permitir a ligação do corante com moléculas carregadas negativamente como a superfícies de bactérias e EPS em um biofilme (PANTANELLA et al., 2013)
A influência dos extratos de própolis verde sobre a capacidade de adesão desses isolados foi testada com 0,16; 0,63; 2,5 e 10,0 mg.mL-1 de cada extrato (EEP
e ECP) nas mesmas condições de adesão do biofilme controle (sem tratamento), incubados a 37ºC por 6, 12, 24 e 48 horas.
Os tratamentos com as diferentes concentrações de EEP e ECP foram comparados com os resultados obtidos nos ensaios de avaliação da capacidade de adesão, nos quais a capacidade de adesão de cada cepa foi verificada sem tratamento com os extratos de própolis,
As figuras 2 e 3 apresentam os perfis de densidade óptica dos tratamentos aplicados nos biofilmes incubados à 37ºC por 6 horas, para as cepas E. faecalis F68 e E. faecium C1E105, respectivamente.
Neste período de incubação, ambas as cepas apresentavam perfil de adesão fraca no biofilme sem tratamento. Os tratamentos com EEP a 0,63; 2,5 e 10 mg.mL-1
cepas avaliadas. Os tratamentos com EEP a 0,16 mg. mL-1 e ECP a 2,5 mg. mL-1
não afetaram a capacidade de adesão de ambas as cepas que se mantiveram fracas, assim como observado no biofilme controle. Apesar da manutenção do perfil de adesão, observou-se que estes tratamentos promoveram a redução da densidade óptica da cepa E. faecium C1E105, indicando que este tratamento provavelmente afetou na redução da quantidade de células aderidas.
A capacidade de adesão da cepa E. faecalis F68, foi aumentada nos tratamentos com ECP a 0,16 e 0,63 mg.mL-1, com aumento da densidade óptica que
ocasionou mudança do perfil de adesão dessa cepa que ficou entre fraco e moderado (DO 540 nm > 0,3 < 1,0) (figura 2). Para a cepa E. faecium C1E105, observou-se aumento da densidade óptica após o tratamento com 0,63 mg.mL-1,
mas o tratamento com 0,16 mg.mL-1 não se diferenciou do biofilme controle, ambos
os tratamentos mantiveram o perfil de adesão fraca.
Figura 2: Influência dos extratos de própolis na capacidade de adesão de E. faecalis F68 após 6 horas de incubação à 37ºC.
1Médias de DO540 e barras de erro padrão. 2Tratamentos aplicados: controle positivo de
adesão (sem tratamento com extratos de própolis); EEP: extrato etanólico de própolis verde; ECP: extrato concentrado de própolis verde; 1) 0,16 mg. mL-1; 2) 0,63 mg. mL-1; 3) 2,5
Figura 3: Influência dos extratos de própolis na capacidade de adesão de E. faecium C1E105 após 6 horas de incubação à 37ºC.
1Médias de DO540 e barras de erro padrão.2Tratamentos aplicados: controle positivo de
adesão (sem tratamento com extratos de própolis); EEP: extrato etanólico de própolis verde; ECP: extrato concentrado de própolis verde; 1) 0,16 mg. mL-1; 2) 0,63 mg. mL-1; 3) 2,5
mg.mL-1; 4) 10,0 mg. mL-1.
Nos biofilmes incubados por 12 horas a 37ºC, ambas as cepas apresentavam perfil de adesão fraca no biofilme controle. O tratamento com EEP a 10 mg.mL-1 não
promoveu a adesão de ambos os isolados (Figuras 4 e 5). A aplicação de EEP a 2,5 mg.mL-1 também favoreceu para que não ocorresse a adesão da cepa E. faecalis
F68, mas não teve efeitos a capacidade de adesão da cepa E. faecium C1E105, Um aspecto interessante avaliado nesse estudo indicou que todos os demais tratamentos (EEP a 0,63; 0,16 mg.mL-1 e ECP em todas as concentrações
avaliadas) acarretaram num aumento da capacidade de adesão de ambas as cepas, a qual passou de fraca (DO540nm > 0,06 a <0,3) a moderada (DO540nm > 0,3 a <1,0)
Figura 4: Influência dos extratos de própolis na capacidade de adesão de E. faecalis F68 após 12 horas de incubação à 37ºC.
1Médias de DO540 e barras de erro padrão.2 Tratamentos aplicados: controle positivo de
adesão (sem tratamento com extratos de própolis); EEP: extrato etanólico de própolis verde; ECP: extrato concentrado de própolis verde; 1) 0,16 mg. mL-1; 2) 0,63 mg. mL-1; 3) 2,5
mg.mL-1; 4) 10,0 mg. mL-1.
Figura 5: Influência dos extratos de própolis na capacidade de adesão de E. faecium C1E105 após 12 horas de incubação à 37ºC.
1Médias de DO540 e barras de erro padrão.2Tratamentos aplicados: controle positivo de
adesão (sem tratamento com extratos de própolis); EEP: extrato etanólico de própolis verde; ECP: extrato concentrado de própolis verde; 1) 0,16 mg. mL-1; 2) 0,63 mg. mL-1; 3) 2,5 mg.
Os biofilmes formados após 24 horas de incubação apresentaram perfil de adesão moderada nos biofilmes controle, sendo esta a maior capacidade de adesão observada para ambas as cepas avaliadas. Os tratamentos com EEP em concentrações iguais ou superiores a 0,63 mg.mL-1 promoveram a inibição da
capacidade de adesão de ambas as cepas avaliadas (Figuras 6 e 7).
O tratamento com ECP contra a cepa E. faecalis F68, só foi efetivo na inibição da capacidade de adesão a 10 mg.mL-1. Os tratamentos com ECP em
concentrações iguais ou inferiores a 2,5 mg.mL-1 resultaram num aumento da
DO540nm quando comparado com o biofilme controle, no entanto, manteve-se perfil
de adesão moderada.
A aplicação de EEP a 0,16 mg.mL-1 e de ECP a 10,0 mg.mL-1 contra a cepa
E. faecium C1E105 promoveu a redução da capacidade de adesão dessa cepa, a qual passou a ter adesão fraca com estes tratamentos. Os tratamentos com ECP em concentrações iguais ou inferiores a 2,5 mg.mL-1 resultou na manutenção do perfil
de adesão moderada observado para o biofilme controle.
Figura 6: Influência dos extratos de própolis na capacidade de adesão de E. faecalis F68 após 24 horas de incubação à 37ºC.
1Médias de DO540 e barras de erro padrão. 2Tratamentos aplicados: controle positivo de
adesão (sem tratamento com extratos de própolis); EEP: extrato etanólico de própolis verde; ECP: extrato concentrado de própolis verde; 1) 0,16 mg. mL-1; 2) 0,63 mg. mL-1; 3) 2,5
Figura 7: Influência dos extratos de própolis na capacidade de adesão de E. faecium C1E105 após 24 horas de incubação à 37ºC. 1Médias de DO540 e barras de erro padrão.
Tratamentos aplicados: controle positivo de adesão (sem tratamento com extratos de própolis); EEP: extrato etanólico de própolis verde; ECP: extrato concentrado de própolis verde; 1: 0,16 mg. mL-1; 2: 0,63 mg. mL-1; 3: 2,5 mg. mL-1; 4: 10,0 mg. mL-1.
Os biofilmes controle formados após 48 horas de incubação a 37ºC possuíam perfil de adesão fraca. Para esta condição, somente o EEP foi efetivo na inibição da capacidade de adesão das cepas avaliadas, com os seguintes tratamentos: a 10 mg.mL-1 contra a cepa E. faecalis F68 e a 2,5 e 10 mg.mL-1 contra a cepa E. faecium
C1E105 (Figuras 8 e 9).
A cepa E. faecalis F68 manteve perfil de adesão fraca quando foi tratada com EEP a 2,5 mg. mL-1. No entanto, os tratamentos com EEP a 0,16 e 0,63 mg.mL-1 e
com todos os tratamentos de ECP acarretaram num aumento da DO 540 nm
capacidade de adesão dessa cepa, resultando num perfil de adesão moderado (Figura 8).
Aumento da DO540 nm foi observado para a cepa E. faecium C1E105 nos
tratamentos com EEP em concentrações iguais ou inferiores a 0,63 mg.mL-1 e com
ECP em todas as concentrações avaliadas no estudo. Para esta cepa, embora o aumento DO 540 nm nos tratamentos realizados com 0,16 mg.mL-1 de EEP e com 2,5
mg.mL-1 de ECP resultaram em médias de DO 540 nm > 0,3, não se pode afirmar que
estes resultaram num perfil de adesão moderada, pois o erro padrão desses tratamentos resulta em DO 540 nm < 0,3.
Figura 8: Influência dos extratos de própolis na capacidade de adesão de E. faecalis F68, formado após 48 horas de incubação à 37ºC. 1Médias de DO540 e barras de erro padrão.
Tratamentos aplicados: controle positivo de adesão (sem tratamento com extratos de própolis); EEP: extrato etanólico de própolis verde; ECP: extrato concentrado de própolis verde; 1: 0,16 mg. mL-1; 2: 0,63 mg. mL-1; 3: 2,5 mg. mL-1; 4: 10,0 mg. mL-1.
Figura 9: Influência dos extratos de própolis na capacidade de adesão de E. faecium C1E105, formado após 48 horas de incubação à 37ºC. 1Médias de DO540 e barras de erro
padrão.
Tratamentos aplicados: controle positivo de adesão (sem tratamento com extratos de própolis); EEP: extrato etanólico de própolis verde; ECP: extrato concentrado de própolis verde; 1: 0,16 mg. mL-1; 2: 0,63 mg. mL-1; 3: 2,5 mg. mL-1; 4: 10,0 mg. mL-1.
Os resultados apresentados neste estudo indicam que o perfil de adesão inicial de cada cepa, tempo de formação de biofilmes e tratamentos aplicados
influenciaram na capacidade de adesão das cepas E. faecalis F68 e E. faecium C1E105.
As principais diferenças dos resultados obtidos em cada tratamento foram observadas para os biofilmes que apresentavam perfil de adesão fraca no biofilme controle (6, 12 e 48 horas).
Nestes períodos de incubação, observou-se que a eficiência do EEP contra a cepa E. faecalis F68 foi reduzida com o aumento do tempo de incubação, com inibição da capacidade de adesão a partir das concentrações de 0,63; 2,5 e 10 mg.mL-1, para períodos de incubação de 6, 12 e 48 horas respectivamente. A
efetividade dos tratamentos com ECP nestes períodos de incubação foi observada apenas no período de 6 horas nas concentrações de 2,5 e 10,0 mg.mL-1. Este
extrato promoveu aumento da capacidade de adesão (fraca para moderada) em todas as concentrações avaliadas por 12 e 48 horas e a 0,63 e 0,16, para o período de incubação de 6 horas.
Avaliando-se os mesmos períodos de incubação para a cepa E. faecium C1E105, observou-se a efetividade do EEP no período de 6 horas foi igual a observada para a cepa E. faecalis F68. No entanto, esta cepa mostrou-se mais resistente ao tratamento com EEP após 12 horas de incubação do que com 48 horas de incubação, sendo inibida com concentrações iguais ou superiores à 10,0 e 2,5 mg.mL-1, respectivamente. Os tratamentos com ECP mostraram eficiência
semelhante à observada para a cepa E. faecalis F68, sendo mais efetivo na inibição capacidade de adesão da cepa E. faecium C1E105 formadas após 48 horas, onde concentrações iguais ou superiores a 2,5 mg.mL-1 de ECP inibiram a capacidade de
adesão dessa cepa.
Um aspecto contraditório que foi observado neste estudo indicou que o período em que as duas cepas apresentaram maior capacidade de adesão no biofilme controle (37ºC/ 24 horas) também indicou efetividade do EEP e ECP em menores concentrações que biofilmes que inicialmente apresentavam menor capacidade de adesão (12 e 48 horas).
Uma das principais hipóteses que pode justificar pode estar relacionada às limitações da metodologia de identificação da capacidade de adesão por cristal violeta (CV), que pode incluir: probabilidade de interação do cristal violeta com compostos orgânicos; não é possível se identificar o perfil de células viáveis
presentes no biofilme, não é possível se identificar a presença de exopolissacarídeos (EPS) (BROWN et al., 2013; PANTANELLA et al., 2013).
Os extratos de própolis verde possuem uma série de compostos orgânicos que podem ter interagido com o cristal violeta, incluindo os compostos fenólicos, ceras e outros compostos lipofílicos, sendo os dois últimos presentes em maior concentração no ECP (SIRIPATRAWAN; VITCHAYAKITTI; SANGUANDEEKUL, 2013). Para tentar solucionar os problemas inerentes a interação do corante cristal violeta com os compostos orgânicos presentes nos extratos de própolis, descontaram-se os valores de DO 540 nm dos poços não inoculados tratados com
cada concentração de EEP ou ECP. No entanto, alguns desvios, que não puderam ser identificados com a leitura dos poços em branco, podem ter interferido na leitura dos resultados, incluindo: interação do composto fenólico com produtos do metabolismo do micro-organismo e a produção de outros compostos orgânicos pelo micro-organismo, que não necessariamente estariam envolvidos com o processo de adesão (PANTANELLA et al., 2013). Assim, em valores menores de densidade óptica, como foi observado para os biofilmes controle formados após 6, 12 e 48 horas (DO 540 nm), a comparação de eficiência dos extratos seria dificultada, não
permitindo resultados conclusivos sobre o efeito dos extratos na capacidade de adesão do micro-organismo.
Neste sentido, outros métodos são recomendados para serem complementares ao método do cristal violeta. A microscopia confocal a laser é um método semi-quantitativo que permite a identificação de células dispostas em um biofilme, as quais podem ser marcadas após a coloração com marcadores fluorescentes. Dentre os principais marcadores de células bacterianas estão o SYTO 9®, que se liga aos ácidos nucleicos de células bacterianas, corando-as de verde, e o iodeto de propídio, que é capaz de penetrar em células danificadas (mortas), marcando-as de vermelho. Estes marcadores permitem a visualização e posterior quantificação de células vivas e mortas dispostas em um biofilme (CHEN et al., 2013; SINGLA; HARJAI; CHHIBBER, 2014)
Assim, para se verificar o perfil de células viáveis e as características dos biofilmes tratados e não tratados com extratos de própolis verde realizou-se ensaios de microscopia confocal a laser utilizando o marcador LIVE/DEAD (Invitrogen). Para este ensaio, selecionou-se a cepa E. faecalis F68, que teve maior alteração nos
biofilmes tratados com ECP, e a condição incubação a 37ºC por 24 horas, por serem identificadas as maiores capacidades de adesão nos biofilmes controle.
A Figura 10 apresenta os valores médios de células viáveis e mortas presentes no biofilme de E. faecalis F68, com e sem a aplicação de ECP e EEP nas mesmas concentrações utilizadas nos ensaios de cristal violeta.
O Biovolume de células aderidas nos biofilmes sem tratamento com própolis foi de 0,8 log de células/ µm3 tanto no biofilme formado somente com caldo BHI,
quanto para o biofilme formado com BHI + 20% de etanol (máxima proporção de etanol do EEP a 10,0 mg.mL-1). Conforme relatado nos ensaios de viabilidade celular
(CMI), a presença do etanol no EEP não afetou diretamente no aumento na atividade desse extrato, nas concentrações avaliadas nesse estudo (Figura 10).
Figura 10: Biovolume de células viáveis e mortas no biofilme de E. faecium F68 tratado com diferentes concentrações de EEP e ECP. Tratamentos: C+ = Controle positivo; C+ etanol = Controle positivo adicionado de 20% de etanol; EEP = extrato etanólico de própolis verde; ECP extrato concentrado de própolis verde; Concentrações de própolis bruta nos extratos: 1) 0,16; 2) 0,63; 3) 2,5 e 4) 10,0 mg.mL-1.
As imagens de microscopia confocal do biofilme controle (Figura 11) e do biofilme controle adicionado de etanol (Figura 12), mostram que à 37ºC por 24 horas, a cepa E. faecalis F68 apresentou perfil com elevada densidade de células viáveis (coradas em verde), sem células mortas (vermelho), sem a formação de uma
estrutura tridimensional que caracterizaria a produção de uma matriz polimérica de expolissacarídeos (EPS), ao redor das células.
Os EPS são estruturas secretadas por algumas células durante o processo de adesão, facilitando a fixação do micro-organismo na matriz polimérica, aumentando, portanto, a capacidade de adesão do mesmo (CLOETE et al., 2009). As estruturas observadas no biofilme controle corroboram com os resultados apresentados nos ensaios realizados com cristal violeta, que indicaram que a cepa E. faecalis F68 apresentou perfil de adesão moderado à 37ºC/ 24 horas.
Figura 11: Imagens de microscopia confocal a laser do biofilme controle de E. faecalis F68. a) células viáveis e mortas; b) células viáveis; c) células mortas (ampliação 63x4 vezes).
Figura 12: Imagens de microscopia confocal a laser do biofilme de E. faecalis F68 adicionado de 20% de etanol. a) células viáveis e mortas; b) células viáveis; c) células mortas (ampliação 63x1vezes).
O principal aspecto observado neste estudo aponta que o EEP mostrou eficiência na redução da capacidade de adesão da cepa estudada em todas as concentrações avaliadas nesse estudo (0,16; 0,63, 2,5 e 10 mg.mL-1), não havendo
células aderidas nos tratamentos com concentrações iguais ou superiores a 0,63