culturas de sangue total estimuladas por antígenos excretados-secretados e bruto de vermes adultos.
___________________________________________________________________34
MATERIAL E MÉTODOS
___________________________________________________________________35 4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 – Delineamento Experimental
O delineamento experimental foi realizado de acordo com o descrito na Figura 10.
Figura 10- Delineamento experimental destacando os principais procedimentos realizados.
___________________________________________________________________36 4.1 – Parasitos
A cepa de A. ceylanicum é mantida no Laboratório de Imunologia e Genômica de Parasitos do Departamento de Parasitologia/ICB/UFMG. Esta cepa foi utilizada para preparações antigênicas (antígenos excretados-secretados e extrato bruto de vermes adultos) utilizadas na avaliação da resposta imunológica.
4.2 – Manutenção dos parasitos
4.2.1 –Manutenção de A. ceylanicum
Para manutenção da cepa de A. ceylanicum foram utilizados hamsters (Mesocricetus auratus), machos, com um mês e meio de idade, nascidos no Biotério de Reprodução do Departamento de Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (ICB/UFMG). Os animais foram mantidos à temperatura ambiente, no Biotério do Departamento de Parasitologia do ICB/UFMG, em gaiolas plásticas, em grupos de cinco animais. A limpeza das gaiolas foi feita duas vezes por semana, com água, detergente e hipoclorito de sódio 12%. Foi fornecido ração granulada balanceada (Labina, Cargill Nutrição Animal) e água potável ad libitum. Os animais foram submetidos previamente ao tratamento oral com 4 mg/kg de Ivermectina (Chemitec Agro) por 7 dias consecutivos (KLEMENT et al., 1996).
Larvas de terceiro estádio (L3) de A. ceylanicum foram isoladas vinte e oito dias após infecção oral com inóculo de 50 larvas. Após contagem do número de ovos por grama de fezes (OPG) pela técnica de McMaster, as fezes foram submetidas à coprocultura. Esta foi realizada sob incubação a 26°C por cinco dias, quando foi realizado o exame de Baermann-Moraes modificado (BARCANTE et al., 2003) para recuperação das larvas L3. Quarenta dias após a infecção, os animais infectados foram eutanasiados por injeção letal de anestésicos. O intestino delgado foi retirado e aberto em placa de Petri contendo solução salina (PBS) para recuperação de vermes adultos. Os procedimentos para manutenção das cepas foram devidamente aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da UFMG (Parecer CETEA 066/2008).
___________________________________________________________________37 4.3 – Produção de antígenos
Para a produção de antígenos excretados-secretados (ES), vermes adultos de A.
ceylanicum foram distribuídos em diversos poços de uma placa de cultura de 8 poços
(NUNC, EUA), os quais foram completados com 2 mL de meio RPMI 1640 (Invitrogen, EUA) e 2% de solução de antibiótico/antimicótico (Invitrogen, Estados Unidos). As culturas foram mantidas em uma atmosfera úmida a 37 ºC e 5% CO2. Após incubação, sobrenadantes de culturas foram coletados (produtos ES de adultos), centrifugados a 14000 rpm por 3 minutos e filtrados em filtros de seringa 0,22 µm (PVDF, low-protein binding; Millipore EUA). Os produtos ES serão posteriormente armazenados a - 70 ºC até o seu uso.
Vermes adultos remanescentes do cultivo de antígenos ES foram utilizados na obtenção de extratos bruto do parasito. A produção do extrato foi obtida pela maceração mecânica do parasito por macerador de tecidos (Tissue Grinder, Fisher Scientific EUA) seguido da separação de debris por centrifugação a 14000 rpm por 3 minutos. O sedimento foi então descartado e os sobrenadantes armazenados a - 70 ºC até o seu uso.
A quantidade de proteínas em todas as preparações antigênicas foi dosada pelo uso de kit comercial BCA (Pierce BCA kit, Pierce EUA), realizado conforme as instruções do fabricante.
___________________________________________________________________38 4.4 – População do estudo
O estudo foi conduzido com amostras provenientes da área endêmica para ancilostomídeos localizada em Virgem das Graças, área rural do município de Ponto dos Volantes, localizado no Vale do Jequitinhonha Estado de Minas Gerais, e da cidade de São Pedro, localizado na mesma região, conhecida como uma das áreas mais pobres do país (Figura 11). Nestas regiões, a transmissão potencial de geohelmintos é elevada, pois o saneamento básico é inexistente, e as condições de higiene são precárias (GAZZINELLI et al., 2006).
Figura 11- Localização geográfica da população de estudo (Fonte: Google Earth acessado em 08/2010).
A presença da infecção foi determinada pela técnica de sedimentação por formalina-éter (RITCHIE et al., 1972) e, se positiva, duas amostras adicionais de fezes foram analisadas pela técnica de esfregaço fecal Kato-Katz (KATZ et al., 1972); a carga parasitária foi expressa em ovos por grama de fezes (opg). Foram consentidos entre 80 a 120 indivíduos residentes na área endêmica e que apresentem infecção moderada ou alta (BROOKER et al., 2004; BETHONY et al., 2006a). O mesmo número de doadores sadios, residentes em Belo Horizonte (Minas Gerais) e não expostos à infecção por ancilostomídeos, foi selecionado como controle. Em caso de diagnóstico positivo para helmintos, todos os pacientes foram tratados com Albendazol, dose oral única de 400
___________________________________________________________________39 mg. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto René Rachou/FIOCRUZ (Parecer CEPSH/CPqRR #04/2006) e pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFMG (Parecer ETIC 0449.023.000-09). Termos de consentimento livre e esclarecido foram obtidos de todos os voluntários participantes do estudo.
4.5 – Separação de células mononucleares do sangue periférico
Para separação de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), aproximadamente 35 mL de sangue periférico humano, coletados em tubos heparinizados, foram aplicados lentamente sobre 10 mL de solução de Ficoll-Hypaque (Histopaque® 1.077, Sigma, EUA) em tubos de 50 mL de polipropileno (Falcon 2074, BD Biosciences, EUA), e foram centrifugados a 400 g por 40 minutos em temperatura ambiente. O anel contendo as células mononucleares, formado na interface entre plasma e eritrócitos, foi coletado e lavado por duas vezes a 400 g por 10 minutos com meio RPMI 1640 (Sigma, EUA). O plasma obtido após separação celular foi armazenado a – 70oC para determinação da presença de anticorpos. Ao final, as células foram ressuspendidas para 1 mL, com a contagem das mesmas em câmara hemocitométrica de Neubauer, na diluição de 1:20 em Solução de Azul de Trypan (Sigma, EUA).
4.6 – Culturas de células mononucleares do sangue periférico
5 x 106 células mononucleares do sangue periféricos (PBMCs ) foram incubadas a 37oC e 5% CO2 em placas de 24 poços, em duplicatas, na presença ou ausência dos
antígenos do parasito (produtos ES e extrato bruto de vermes adultos), na concentração de 5 μg/poço, em meio RPMI 1640 (Invitrogen, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado (Sigma, EUA), 3% de solução de antibiótico/antimicótico (Invitrogen, EUA) e 2 mM de L-glutamina (Sigma, EUA). Culturas adicionais com estimulação por mitógeno (PHA, Sigma, EUA) na concentração de β,5 μg/poço, e estimulação por 3 dias a 37oC e 5% CO2 foram realizadas para determinação da
___________________________________________________________________40 4.7 – Detecção de proliferação celular em populações específicas de linfócitos por CFDA-SE (Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)
Para detecção de proliferação celular, as culturas de PBMCs foram estimuladas por 4 dias com antígenos de A. ceylanicum (produtos ES e extrato bruto de vermes adultos). Os PBMCs foram marcados com aproximadamente 5 µg/mL de CFDA-SE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) VybrantTM CFDA-SE Cell Tracer Kit, Molecular Probes,USA) para cada 1x107 células, conforme protocolo descrito pelo fabricante.
4.8 – Determinação da produção de citocinas em sobrenadantes de culturas As citocinas IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TGF- , TNF-α, IFN- , IL-12p40/IL-23, IL- 17 e IL-23 foram detectadas e quantificadas nos sobrenadantes de culturas de PBMCs, através da técnica de ELISA utilizando-se kits comerciais anti-citocinas humanas (R&D Systems, EUA). Os ensaios foram realizados de acordo com as instruções do fabricante.
4.9 – Determinação do perfil de células reguladoras e células Th17, e avaliação funcional após estímulo de PBMCs com antígenos de A. ceylanicum
Culturas de sangue total na presença de antígenos de A. ceylanicum, foram incubadas por 48 horas em 37oC/5% CO2. Nas últimas 4 horas de cultura foi acrescido
10 μg/mL de Brefeldin A (Sigma, EUA). Após tempo total de incubação, as células foram marcadas com anticorpos específicos para CD4 e CD25 por 30 minutos e à temperatura ambiente, protegidas da luz. As células foram então permeabilizadas em PBS contendo 0,5% de saponina (Sigma, EUA) por 15 minutos. Finalmente, as células foram incubadas com anticorpos monoclonais reativos a IL-10, CD152/CTLA-4, GITR, TGF- , IL-17, IFN- e FOXPγ marcados com fluorocromos (CD4 PerCP,CDβ5 FITC, FOXP3 APC, IL-17 PE, IL-10 PE, TGF- PE, GITR PE, CTLA-4 PE (BD Biosciences, EUA). Os dados sobre as células marcadas foram adquiridos em um citômetro de fluxo FACScalibur (BD Bioscience), selecionando-se as populações de linfócitos ou monócitos. Trinta mil eventos foram adquiridos e analisados pelo software Cell Quest
___________________________________________________________________41 (BD Biosciences, EUA). Controles isotípicos, marcados com FITC, PE, PE-Cy5 e APC, foram usados em todos os experimentos.
Para a avaliação funcional, linfócitos CD4+CD25+ foram isolados com auxílio da técnica de MACS (magnetic activated cell sorting). Em resumo, a população de interesse foi magneticamente marcada com microesferas anti-CD4 e anti-CD25 (Miltenyi Biotec EUA). Em seguida, a suspensão celular foi submetida a um campo magnético de um separador MACS (QuadroMACS®, Miltenyi Biotec, EUA). Células não marcadas passaram pela coluna e foram agrupadas para posterior utilização. Após remoção da coluna do campo magnético, as células magneticamente retidas foram eluídas (PBS pH 7,2 com 0,5% BSA e 2 mM EDTA), lavadas (PBS) e contadas em câmara de Neubauer. A população de células CD4+CD25+ obtidas alcançou 90% de pureza, conforme representado na Figura 12:
Figura12- Em A, FACS plot com gate representativo da população de linfócitos. Em B FACS plot representando no eixo Y as células marcadas com CD25+ e o eixo X as células CD4+. O gráfico B representa as células CD4+CD25+,com pureza equivalente a 90,4%. Dados adquiridos com o programa CellQuest (BD Biosciences, EUA) (RICCI et al., 2011).
Células CD4+CD25+ foram co-incubadas (50.000 células) com uma proporção de 1:10 PBMCs autólogos estimulados por mitógenos e antígenos do parasito, em ambiente de 37oC e 5% CO2, por 3 (mitógeno) e 6 (antígenos) dias de incubação. A
proliferação de PBMCs foi avaliada por marcação celular, utilizando-se CFDA-SE (Molecular Probes, EUA), conforme as instruções do fabricante. As células agrupadas
___________________________________________________________________42 que foram recuperadas na coluna magnética, denominadas de PBMCs depletadas de células CD4+CD25+ (PBMCd), foram incubadas tal como descrito para os PBMCs autólogos.
4.10 -Estudo da ocorrência de polimorfismos pela técnica de RFLP- Polimorfismo dos Fragmentos de Restrição
4.10.1 – Extração de DNA Genômico
O DNA genômico foi obtido a partir de amostras de sangue total de pacientes de positivos e negativos para infecção por ancilostomídeos. O DNA foi extraído utilizando- se o kit Wizard (Promega, EUA), conforme instruções do fabricante, e armazenado em freezer -20ºC até o momento do uso.
4.10.2 –– Quantificação do DNA
O DNA foi quantificado e avaliado quanto à sua concentração (ng/µL) e à sua pureza por meio da densidade óptica, através da relação dos comprimentos 260/280 nm, em espectrofotômetro Nanodrop® ND-1000 (Thermo Scientific, EUA). O DNA posteriormente foi quantificado quanto à sua qualidade por meio da análise em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídio, visualizado em luz ultravioleta, e as amostras foram comparadas aos padrões, determinando as concentrações aproximadas e o nível de degradação em cada amostra.
4.10.3 – Reação em cadeia da Polimerase (PCR)
Para a realização da técnica de PCR, foi utilizado aproximadamente 150 ng da amostra de DNA, adicionado a uma solução contendo desoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs), a enzima Taq DNA Polimerase (Phoneutria), tampão Go Taq 5x (Promega, EUA) (50 nM KCl, 10 nM tris-HCl, 0,1%, pH 8,4, Triton x-100, MgCl2 1,5 nM),
acrescidos dos iniciadores (0,5μM) para cada gene em questão, acrescidos de água Milli-Q para se completar 50 µL de reação.
___________________________________________________________________43 Tabela 3- Locus gênicos amplificados
Gene Locus Referência na literatura Iniciador direto
5’ 3’
Iniciador Reverso 5’ 3’
IL-10 -1082 G/A Koch et al., 2001 CCAAGACAACACTACTA
AGGCTCCTTT
GCTTCTTATAGCTAGT CAGGTA
CTLA-4 +49A/G Donner et al., 1997 GCTCTACTTCCTGAAGA
CCT AGTCTCACTCACCTTT GCAG TGF- 869 C/T Fen Wu et al., 2008 CTTCCGGGTGGGGCTGC GGC CGGCACCTCCCCCTG GCTCG
FOXP3 IV59 459 A/G
(rs 2280883)
Gao et al.,2010 TACACCCCAATGGGAGC TGGGGTTCGGTGTGG
AGTGA
A amplificação do DNA foi realizada em termociclador automático (TC-312, TECHNE) nas seguintes condições:
1-Desnaturação inicial: 94o C por 10 minutos
2-Anelamento: por 30 segundos (com temperatura específica para cada par de iniciadores, ver Tabela 4).
3-Extensão: 72o C por 45 segundos 4-Desnaturação: 94o C por 30 segundos
5-Repetição das etapas (2), (3) e (4) por 40 vezes 6-Extensão final: 72o C por 7 minutos
___________________________________________________________________44 Tabela 4- número de ciclos, temperatura de anelamento e tamanho do fragmento obtido para a técnica de PCR.
Gene Número de
ciclos
Temperatura de anelamento
Tamanho do fragmento obtido
IL-10 40 56 377 pb
CTLA-4 30 58 162 pb
TGF- 30 67 199pb
FOXP3 40 60 327pb
4.10.4 –– Eletroforese em gel de Agarose 1%
Para a visualização do material amplificado pelas PCR, estes foram analisados através de eletroforese em gel de agarose 1,0% corado com brometo de etídio (0,5 µg/ml) e visualizados no sistema de fotodocumentação AlphaDigiDoc (AlphaInnotech, EUA). As intensidades das bandas foram determinadas por comparação com padrões de massas moleculares conhecidas de DNA. Como padrões de massa molecular de DNA foram utilizados 100 pb DNA ladder (Fermentas, EUA) ou 100 pb DNA ladder (Life Technologies, EUA).
4.10.5 – Digestão dos Produtos de PCR
Os produtos de PCR foram submetidos à digestão por enzimas de restrição específicas para cada sequência (Tabela 5). Ao produto de PCR, foram adicionadas quantidades específica de enzima (aproximadamente 2 unidades para cada 0,5 µg de produto de PCR) e tampão, de acordo com o protocolo do fabricante. Em seguida, o material foi incubado em termociclador por 37ºC ou 65ºC por 4 horas seguidas de incubação de 65ºC por 20 minutos para inativação enzimática.
___________________________________________________________________45 Tabela 5- Enzimas utilizadas na digestão e produtos de digestão gerados para reconhecimento dos genótipos.
Gene Polimorfismo Produtos da digestão em relação aos fenótipos Enzimas de restrição IL-10 -1082 G/A GG: 253pb 97pb 27pb AG: 280pb 253pb 97pb 27 pb AA: 280 pb 97 pb ECONI (XAGI) (Fermentas)
CTLA-4 +49 A/G AA:162 pb
AG:162pb 88pb 74 pb GG: 88pb74 pb Bbv I (Fermentas) TGF- +869 C/T (rs1982073) CC: 182bp, 17bp CT: 199bp, 182pb,17bp TT: 199bp NOT I (Fermentas) FOXP3 459 A/G (RS 2280883) GG: 327pb GA: 327 pb, 307pb, 20pb AA: 307pb, 20pb BsmI (Fermentas)