CAPACIDADES DE ADSORÇÃO DINÂMICA

Como referido anteriormente, a determinação da capacidade de adsorção dinâmica (CLD) de uma fase estacionária é um passo fundamental para a otimização de um processo de purificação, apresentando-se como um fator crítico para a desempenho de uma coluna (SOUSA; PRAZERES; QUEIROZ, 2007).

Os ensaios de ruptura foram realizados a 1 mL/min, com uma solução pré- purificada de pVAX1-GFP (0,05 mg/mL) a pH 8,0. A Figura 14 mostra as curvas de ruptura obtidas para as colunas monolíticas de arginina, di-arginina e tri- arginina nessas condições cromatográficas. Neste ponto, é importante referir que a escolha do valor de pH baseou-se na vantagem de capacidade verificada anteriormente em estudos na literatura em resinas monolíticas, em termos de capacidade e seletividade do pDNA, face principalmente à impureza de RNA (ALMEIDA et al., 2015). As capacidades foram calculadas a 10% e 50% da absorbância das curvas de ruptura, cujos valores estão representados na Tabela 11.

Figura 14 – Ensaios de ruptura das resinas monolíticas imobilizadas com arginina, di-arginina e tri-arginina. Vazão: 1 mL/min; amostra: pVAX1-GFP pré-purificada (0,05 mg/mL) com o kit NZYMaxiPrep em tampão 20 mmol/L Tris-HCl e 10 mmol/L EDTA (pH 8,0).

Tabela 11 - Capacidades de ligação dinâmicas das resinas monolíticas com arginina, di-arginina e tri- arginina imobilizadas, determinadas com uma solução de 0,05 mg/mL do plasmídeo pVAX1-GFP.

Resina monolítica CLD (mg/mL)

10% 50% Total

Arginina 1,02 1,10 1,54

Di-arginina 2,64 2,85 3,49

Tri-arginina 2,62 2,78 3,60

Os dados da Tabela 11 indicam que a CLD depende efetivamente do comprimento da cadeia do ligante de arginina. Observou-se um aumento significativo de capacidade no caso das coluna monolíticas baseadas em homopeptídeos de arginina, que mostraram capacidades aproximadamente 2,5 vezes superiores com relação à coluna monolítica imobilizada com o aminoácido de arginina. Uma explicação para esta diferença pode estar relacionada ao fenômeno de condensação que ocorre entre o peptídeo de arginina e as moléculas de pDNA. De fato, os homopeptídeos catiônicos de arginina foram

estudados anteriormente, em solução, para procedimentos de administração de genes, apresentando boas habilidades de transfeção em comparação com outros aminoácidos. Os homopeptídeos de arginina têm mostrado alto potencial para condensar o DNA por interações eletrostáticas combinadas com pontes de hidrogênio entre a cadeia lateral de íon guanidínio da arginina e as bases nitrogenadas do plasmídeo (BALHORN; BREWER; CORZETT, 2000; MANN et al., 2011). Por analogia, levando-se em conta a possibilidade de neste caso os peptídeos poderem mostrar um comportamento diferente do que teriam livres em solução devido ao impedimento estérico da superfície sólida e à perda de grupos amino funcionalizados, esta comparação sugere que a imobilização de homopeptídeos de arginina aumenta a intensidade de interação dos ligantes com o pDNA. Consequentemente, a capacidade de adsorção dinâmica das resinas monolíticas melhora relativamente à coluna monolítica de arginina, mesmo com as menores densidades iônicas apresentadas. A possibilidade de formar complexos mais condensados entre as moléculas de pDNA com o ligante, resultantes do número crescente de interações eletrostáticas e séries de pontes de hidrogênio com o íon guanidínio (MANN et al., 2011), podem ter igualado a quantidade de plasmídeo confinado no interior da coluna de tri-arginina, mesmo com o menor rendimento de imobilização apresentado. Estes resultados mostram a vantagem do aumento do comprimento do peptídeo de arginina na eficácia de ligação de pDNA, que se traduz diretamente em maiores capacidades de adsorção dinâmica.

De acordo com resultados anteriores, de fato a imobilização de ligantes de arginina na resina monolítica torna o suporte mais funcional, permitindo aumentar a sua capacidade de adsorção em comparação com resinas cromatográficas convencionais (ALMEIDA et al., 2015). Estes resultados também sugerem que a implementação da cromatografia de afinidade recorrendo ao aminoácido de arginina combinada com as vantagens das resinas monolíticas, surge como uma boa alternativa com relação, à resina histidina- agarose, que apresenta uma capacidade consideravelmente menor para o pDNA, exigindo maiores concentrações de sal para promover a total retenção desta molécula (SOUSA et al., 2008).

Analisando os perfis de curvas de ruptura (Figura 14), todas estas apresentaram um formato em “S”, geralmente descritas por um avanço íngreme seguido de uma plataforma plana, quando as resinas atingem a saturação. No entanto, é notável como o formato da curva se modifica à medida que o comprimento do ligante é alterado, especialmente no caso da resina monolítica de tri-arginina. Essas diferenças das curvas de ruptura estão de acordo com o trabalho de Gebauer e colaboradores, que descreveram o formato das curvas de ruptura como sendo dependentes de vários fatores. Esses fatores podem incluir a cinética de adsorção das interações ligante-soluto, mecanismos de transferência de massa difusional ou o impedimento estérico dos ligantes (LUSTIG; ARORA; JERNIGAN, 1997).

A fim de compreender melhor se o diferente formato das curvas estava diretamente relacionada com esses fenômenos ou se seria o resultado das diferentes características fisico-dinâmicas apresentadas pelos resinas após imobilização, foram analisadas as curvas de ruptura sob condições de não adsorção para os três resinas. Para a realização desse ensaio, foi feito o carregamento da amostra de pDNA diluída em um tampão de alta concentração de sal (2 mol/L NaCl em 20 mmol/L Tris-HCl EDTA 10 mmol/L, pH 8,0), para assegurar que nenhuma interação ocorreria entre o ligante e o pDNA. De fato, nessa condição de força iônica, nenhuma interação foi encontrada, e as curvas de ruptura apresentaram a mesma forma, independentemente do ligante (ver apêndice II). Estes fatos corroboram no sentido de que o formato das curvas de ruptura pode ser altamente influenciado pelo comprimento da cadeia de argininas, como de outros fatores, como a densidade de ligantes na coluna, que pode resultar em uma mudança do espaço disponível para interação com o pDNA, ou pelo próprio grau de compactação do plasmídeo quando em interação com o ligante. Esses fatores podem causar alterações nos mecanismos de transferência de massa dentro da coluna monolítica, resultando em variações na extensão do tempo necessário para atingir o platô de saturação. Estes resultados indicam que esse formato das curvas pode ser altamente influenciado pelo comprimento da cadeia arginina, que podem ser responsáveis pela alteração da sua interação com DNA plasmidial, bem como da sua compacidade de interação. Por sua vez, essas alterações podem causar mudanças de mecanismos de

transferência de massa dentro da coluna monolítica, resultando em variações na extensão do tempo necessário para atingir o patamar de saturação.

5.3.3 PURIFICAÇÃO DE DNA PLASMIDIAL DIRETAMENTE DE LISADO