RESULTADOS Parte 2 5 Ensaio da funcionalidade da proteína GST-NcGSK Fosforilação do Inibidor-
2- Caracterização da enzima glicogênio sintase quinase-3 em N crassa.
Um outro aspecto abordado neste trabalho foi a caracterização molecular e funcional da enzima GSK-3 no fungo N. crassa, analisando seu papel fisiológico na biologia celular e no metabolismo de glicogênio global.
A clonagem molecular do cDNA codificando para esta enzima em N. crassa (NcGSK) permitiu a realização de vários estudos os quais trouxeram importantes informações sobre sua função celular. A análise da seqüência de aminoácidos, deduzida a partir da seqüência nucleotídica, mostrou que esta proteína é bastante conservada do ponto de vista evolutivo, evidenciado pelo alto grau de identidade entre proteínas variando desde leveduras até humanos. Uma característica interessante com relação à proteína GSK-3 é o fato da mesma ser ativa na ausência de estímulos externos e ser inibida em resposta a sinais mediados por receptores acoplados a membranas. As proteínas de humanos apresentam dois resíduos de serina (Ser21 na isoforma α e Ser9 na isoforma β), os quais são fosforilados e levam a inativação da enzima [127]. Estes resíduos, entretanto estão ausentes na proteína de N. crassa. Além da fosforilação de tais resíduos, esta quinase também é fosforilada em um resíduo de tirosina (Tyr279 na hGSK-3 α eTyr216 na hGSK-3 β). A fosforilação nestes resíduos é essencial para a funcionalidade da proteína e desfosforilação dos mesmos em resposta a estímulos externos levou a uma inativação da atividade quinase. Este sítio de fosforilação é conservado na enzima NcGSK como Tyr279. Um estudo bastante recente demonstrou que estes resíduos de tirosina nas isoformas humanas são modificados por autofosforilação [128].
[127] Sutherland, C.; Leighton, A. and Cohen, P. (1993) Inactivation of glycogen synthase kinase-3β by phosphorylation: new kinase connections in insulin and growth-factor signalling. Biochem. J. 296: 15-19. [128] Cole, A.; Frame, S. and Cohen, P. (2004) Further evidence that the tyrosine phosphorylation of glycogen synthase kinase-3 (GSK3) in mammalian cells is an autophosphorylation event. Biochem. J.
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A introdução de mutações no gene Ncgsk em N. crassa, por RIP, resultou em clones apresentando severas alterações morfológicas e em todos eles, apenas poucas mutações pontuais foram observadas. Considerando que o processo de RIP atua eficientemente em seqüências maiores de 1 kb, algumas possíveis explicações poderiam ser dadas para o baixo número de mutações encontradas. Considerando o papel fundamental da proteína GSK na fisiologia e bioquímica celular em outros organismos, uma possível explicação seria que o grande número de mutações levaria à produção de uma proteína totalmente inativa, o que tornaria o mutante letal. Todos os clones obtidos apresentaram crescimento bastante reduzido e isso poderia corroborar a suposição de letalidade de um mutante completamente nulo. Duas das mutações encontradas no mutante 9-7 levaram a trocas de aminoácidos muito conservados (His85 e Thr245) entre as proteínas GSKs de diferentes organismos. Além disso, o aminoácido Thr245, o qual foi substituído por Ala, encontra-se dentro do “core” de um domínio em α-hélice, conservado entre as proteínas GSKs, assim como entre outras proteínas quinases dependente de mitógeno (MAPKs) [129]. Tais mutações poderiam explicar os fenótipos observados nos mutantes, embora a extensão exata do papel desta proteína, assim como a verdadeira importância para N. crassa só seria possível de ser determinada através da obtenção do mutante nulo. Para isso, novas estratégias de nocaute gênico, através de “gene replacement”, serão realizadas. Uma segunda explicação possível viria a partir de fenótipos observados em mutantes de GSK-3 em S. cerevisiae. Células deste organismo expressam quatro isoformas de GSK-3 e mutação de um destes genes (RIM11) provocou severas deficiências nos processos de meiose e esporulação [130]. Considerando que o processo de RIP ocorre no período pré-meiótico do cruzamento sexual, mutantes no gene Ncgsk poderiam não ser obtidos se um papel deste gene no processo meiótico, de fato, existisse no fungo. Entretanto, tal afirmação é, no momento, difícil de ser suportada uma vez que a análise do comportamento dos mutantes obtidos durante o ciclo sexual não foi estudada mais profundamente.
Dentre os fenótipos observados nas linhagens mutantes, o mais pronunciado foi a baixa taxa de crescimento, acompanhada por conidiação precoce em culturas sólidas. A conidiação constitui um processo de diferenciação celular, onde hifas especializadas (hifas aéreas) emanam da hifa basal e sofrem constrições da parede, levando a formação de estruturas de dispersão, denominados conídios. Este processo, em geral, em culturas crescidas em meio
[129] Dajani, R.; Fraser, E.; Roe, S. M.; Young, N.; Good, V.; Dale, T. C. and Laurence, H. P. (2001) Crystal structure of glycogen synthase kinase 3β: Structural basis for phosphate-primed substrate specificity and autoinhibition. Cell, 105: 721-732.
[130] Zhan, X. L.; Hong, Y.; Zhu, T.; Mitchell, A. P.; Deschenes, R. J. and Guan, K. L. (2000) Essential functions of protein tyrosine phosphatases PTP2 and PTP3 and RIM11 tyrosine phosphorylation in
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sólido inicia-se após 2-3 dias de crescimento e é fortemente induzida por luz. Além disso, uma interface água-ar é necessária para a formação das hifas aéreas e, portanto, esse processo é inibido em culturas líquidas. Interessantemente, análises microscópicas das células mutantes demonstraram que as células sofrem constrições das paredes, levando à formação de conídios, mesmo quando crescidas em culturas líquidas. Este resultado, claramente demonstrou que as células mutantes apresentam uma desrepressão do processo de diferenciação celular, o qual levou à formação de conídios. A observação de que a proteína quinase GSK-3 regula processos tais como crescimento e diferenciação, também foi descrita em D.discoideum, onde esta proteína foi mostrada definir o destino celular entre esporo e corpo de frutificação [131]. Os nossos resultados mostraram uma alteração global no processo de diferenciação celular nos mutantes da proteína NcGSK, possivelmente envolvendo a participação desta proteína.
Uma outra característica da linhagem mutante 9-7 foi a ausência de alterações no conteúdo de glicogênio, assim como na atividade glicogênio sintase (GSN). Entretanto, estes resultados ainda são preliminares e, é importante considerar que NcGSK pode ter um papel no metabolismo global de glicogênio, atuando em alvos diferentes da proteína GSN. Um exemplo disso, foi a habilidade da proteína recombinante NcGSK fosforilar o inibidor INc-1 de N. crassa, o qual controla a atividade da fosfoproteína fosfatase de tipo-1 (PP-1). Estudos adicionais, entretanto, precisam ser feitos para definir com clareza se tal fosforilação tem algum papel relevante no metabolismo de glicogênio. Finalmente, a proteína NcGSK demonstrou ser autofosforilada. Embora exista conservação entre o resíduo Tyr195 da NcGSK e o resíduo Tyr279 da proteína hGSK-3α, a identificação do resíduo auto-fosforilável na enzima NcGSK permanece ainda a ser demonstrado. É importante salientar que o mecanismo de auto- fosforilação, demonstrado existir na enzima GSK-3β de humanos, foi recentemente descrito e, nenhuma evidência de tal evento foi descrita em microrganismos. A auto-fosforilação da enzima de N.crassa constitui, portanto, constitui o primeiro relato deste evento em microrganismos.
[131] Plyte, S. E.; O’Donovan, E.; Woodgett, J.; Strutt, H. and Kay, R. R. (1995) Glycogen synthase kinase-3 (GSK-3) regulates cell fate in Dictyostelium, Cell, 80: 139-148.
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