Caracterização da estrutura e diversidade bacteriana por PCR-DGGE

O perfil da comunidade microbiana das amostras do inóculo e da biomassa do reator coletada após 191, 241 e 417 dias de cultivo no RBS foram avaliadas por meio da técnica de PCR- DGGE (figura 8.2).

Figura 8-2 - Gel de DGGE corado com Sybr-Gold contendo fragmento de DNA ribossomal 16S amplificado com primers universais para Bacteria

(I) Lodo de inóculo; (191d) amostra do RBS após 191 dias de cultivo; (241d) amostra do RBS após 241 dias de operação; (417d) amostra do RBS após 417 dias de cultivo. As bandas enumeradas correspondem às bandas recortadas do gel de DGGE para sequenciamento e identificação dos grupos.

Através do perfil de bandas obtidos pelo DGGE, observa-se um elevado número de espécies em cada amostra, uma vez que, de acordo com a técnica, cada banda pode representar uma população.

O perfil de bandas obtido no gel da DGGE para cada período amostrado, foi comparado utilizando-se o programa BioNumerics (versão 7.1). O programa gerou os coeficientes de similaridade entre os perfis obtidos. A análise do agrupamento separou cada período amostrado em grupos que compartilharam perfis de conjuntos de bandas semelhantes, a partir

de uma matriz de similaridade gerada com presença e ausência das bandas obtidas. A figura 8.3 apresenta o dendograma baseado no perfil de bandas do DGGE.

Figura 8-3. Dendrograma baseado no perfil de bandas do DGGE.

Pelo dendograma, observa-se que a comunidade variou ao longo do tempo de seleção e cultivo no RBS apresentando dois agrupamentos bem distintos, sendo o primeiro: inóculo e amostra com 191 dias e o segundo, amostras dos dias 241 e 417 de operação. Para o primeiro agrupamento (inóculo e dia 191), verificou-se que as amostras são diferentes entre si, apresentando 58,3% de similaridade. Para o segundo agrupamento (dias 241 e 417), verificou- se maior similaridade entre as amostras (81,5% de similaridade). As amostras do inóculo e 191 dias, apresentaram 50,8% de similaridade em comparação às demais amostras, mostrando a dissimilaridade destas em relação às outras. Esses dados indicam que ao longo do enriquecimento houve uma seleção da comunidade microbiana e a estrutura da comunidade microbiana tornou-se bem distinta com relação ao inóculo e também ao tempo de 191 dias. Porém, nos dias 241 e 417 elas foram mais similares entre si, indicando uma maior estabilidade da comunidade microbiana nessas fases. Após o dia 191, aumentou-se o tempo de adição de metano para 6 minutos (a uma vazão de 100mL.CH4.min), totalizando um volume aproximado de 600mL do gás no headspace do reator durante o período P3 (192-241d). Tal fato poderia justificar a alteração na composição da comunidade após 191 dias de operação, mostrando que o aumento no volume de metano poderia ter favorecido o surgimento de alguns grupos que se mantiveram nos períodos P3 (192-241d) e P4 (242-417d) como visualizado no dendograma. Ainda assim, algumas populações visualizadas no dia 241 desapareceram no período final de operação do reator, 417 dias. No período P4 houve novamente uma redução no volume de metano acrescido ao reator, passando de 600mL para 400mL, uma vez que a pressão interna do reator parece ter aumentado consideravalmente levando a perda de sólidos.

Para o perfil de bandas em cada um desses períodos amostrados, o índice de Shannon (H´) foi calculado. O índice H´ mostrou uma maior diversidade para as amostras do inóculo e uma

menor diversidade para o dia 191, seguido pelo dia 417 de operação, indicando que, a comunidade foi selecionada nesses períodos.

A análise da similaridade das bandas excisadas foi realizada, entretanto, muitas sequências apresentaram baixa identidade (menor que 90%), com as sequências inseridas no GenBank e não foram classificadas pelo RDP Classifier. Dessa forma, estas sequências não serão apresentadas nessa discussão uma vez que não foi possível classificá-las nos diferentes níveis taxonômicos, tampouco fazer inferencias sobre a fisiologia desses micro-organismos. De acordo com SCHLOSS e HANDELSMAN (2004), os valores de identidade igual a 97% diferenciam os organismos em nível de espécie, ao passo que 95% permitem classificar em nível de gênero, 90% em nível de família/classe e 80% em nível de filo.

A maioria das bandas apresentaram sequências relacionadas com clones de bactérias não cultivadas provenientes de amostras ambientais (tabela 8.3). Entretanto, destaca-se que, a análise permitiu identificar um perfil de banda predominante em todas as amostras que esta proximamente relacionado à metanotrófica do gênero Methylocaldum (sequências correspondentes às bandas 14, 15, 26 e 43). Além destas, a banda de número 27, apresentou 98% de similaridade com metanotrófica do tipo I (Gammaproteobacteria), que provavelmente também poderia estar relacionado ao gênero Methylocaldum. Entretanto, para esta última, não foi possível a identificação em nível de gênero. O gênero Methylocaldum é composto por metanotróficas do tipo I, que assimilam formaldeído para a formação celular pela via Ribulose Monofosfato. Essas bactérias são aeróbias, mas seu crescimento também já foi relatado em locais onde a concentração de oxigênio dissolvido é baixa, como sedimentos de água doce e oceanos, fermentadores e lodo de reator UASB (CVEJIC et al., 2000; SCHUBERT et al., 2006; FERRER et al., 2011; SINISCALCHI et al., 2015). A tabela 8.3 resume a similaridade do gene RNAr 16S das bandas obtidas no gel acima com sequências de micro-organismos inseridas no GenBank e RDP Classifier.

Tabela 8-3 - Bandas de DGGE (gel mostrado na Figura 8.2) associadas ao gene RNAr 16S

Número da banda

RDP Classifier Número de Acesso no GenBank

Blast Similaridade (%)

14 Domínio Bacteria HF565149.1 Methylocaldum não

cultivado

91

15 Gênero Methylocaldum HF565149.1 Methylocaldum não

cultivado

98

16 Filo Proteobacteria JF683696.1 Burkholderia sp. 91 18 Filo Chloroflexi AY921879.1 Chloroflexi não cultivado 97 19 Filo Chloroflexi HQ061974.1 Uncultured

Anaerolinaceae

96 20 Filo Chloroflexi AY921913.1 Chloroflexi não cultivado 99 21 Filo Chloroflexi HQ640641.1 Bactéria não cultivada 99

26 Gênero Methylocaldum HF565149.1 Methylocaldum sp. não

cultivado

98

27 Classe

Gammaproteobacteria

AB669155.1 Metanotrófica tipo I 98

28 Domínio Bacteria CU925340.1 Acidobacteria não cultivado 97 29 Ordem Solirubrobacterales HQ213036.1 Solirubrobacter sp. não cultivado 99 30 Família Pseudomonadaceae KM376217.1 Pseudomonas putida 99 31 Domínio Bacteria JN791039.1 Firmicutes não cultivado 100 35 Domínio Bacteria FJ551881.1 Gemmatimonas sp. 90 38 Filo Chloroflexi AY921707.1 Chloroflexi não cultivada 98 39 Filo Chloroflexi AY921913.1 Chloroflexi não cultivada 97 40 Domínio Bacteria AB500053.1 Acidobacteria não

cultivada

98

43 Gênero Methylocaldum HF565149.1 Methylocaldum sp. não

cultivada

98

44 Domínio Bacteria JX559107.1 Novosphingobium sp. não cultivada

100 45 Domínio Bacteria FJ710638.1 Planctomycetales não

cultivada

91

As bandas em negrito representam os gêneros de metanotróficas identificados nas amostras coletadas.

Outros filos, ordens, famílias e/ou gêneros não relacionados à metanotróficas foram identificados.

As bandas de número 18, 19, 20, 21, 38 e 39, conforme elucidado na tabela 8.3 apontaram similaridade com o filo Chloroflexi, filo este que engloba bactérias conhecidas como bactérias verdes não sulfurosas. Esses micro-organismos apresentam ampla diversidade metabólica, sendo alguns anaeróbios, fototróficos, mesofílicos ou moderadamente termofílicos, filamentosos e estão presentes em hábitats com ocorrência de enxofre como fontes termais, sedimentos de lagos e rios. Além desses ambientes naturais, também foram relatados em sistemas de tratamento de esgotos, sendo usuais em lodos ativados (KRAGELUND et al., 2011). O filo Chloroflexi apresentou abundância relativa alta (12%), quando detectado por pirosequenciamento, no reator com 100 dias de operação (SINISCALCHI et al., 2015).

A banda 44 foi correlacionada ao gênero Novosphingobium que pertence à classe

Alphaproteobacteria, família Sphingomonadaceae e inclui bactérias desnitrificantes, o que,

provavelmente, seria um dos contribuintes para o consumo de nitrato no interior do reator. Outras desnitrificantes possivelmente presentes estão na família Rhodocyclaceae detectada (banda 23), que inclui também bactérias púrpuras não sulfurosas (FURUHATA et al., 2008). Além destas, a banda 30, apresentou similaridade com Pseudomonas putida, que é uma bactéria heterotrófica capaz de oxidar o íon amônia a nitrito. Esses micro-organismos também estão relacionados à degradação de hidrocarbonetos (BRENNER et al., 2005a). De acordo com HAYATSU et al. (2008) citado por MAC CONELL (2014), os micro-organismos heterótrofos contribuem na nitrificação em solos ácidos e/ou com condições desfavoráveis à proliferação de bactérias nitrificantes autotróficas.

A banda 31 apresentou 100% de similaridade com o filo Firmicutes. Esse grupo é composto por micro-organismos quimiorganotróficos, aeróbios, facultativos ou anaeróbios estritos que inclui representantes como os gêneros Bacillus, Lactobacillus e Clostridium (VOS et al., 2009). LEE et al. (2012) relataram elevada abundância desse filo em digestores anaeróbios mesofílicos e termofílicos.

As bandas 28 e 40 apresentaram respectivamente, 97% e 98% de identidade com o filo

Acidobacteria que é formado por micro-organismos heterotróficos e abundantes em solos e

outros ambientes, tais como hábitats extremos e solos poluídos. Pouco se sabe sobre o filo, mas para o cultivo de membros do grupo, sabe-se que são necessários longos períodos de incubação (KRIEG et al., 2010).

A banda 29 foi classificada como pertencente ao gênero Solirubrobacter (filo Actinobacteria) de acordo com a análise do gene RNAr 16S. Membros desse gênero são quimiorganotróficos, crescem à temperatura que varia de 19 a 38ºC e já foram isolados de solos contendo culturas agrícolas (SINGLETON et al., 2003).

A banda 45 identificou-se com o filo Planctomycetes, constituído por micro-organismos aeróbios facultativos ou anaeróbios relatados em uma ampla variedade de ambientes, tais como solos, água doce, sedimentos oceânicos, além de sistemas de tratamento de esgotos e aterrros sanitários (KRIEG et al., 2010). Quanto aos sistemas de tratamento, esse filo foi detectado em filtros biológicos percoladores usados no pós-tratamento de esgoto doméstico e em reatores de leito fixo com meio suporte usados no cultivo de bactérias relacionadas ao

processo Anammox (oxidação anaeróbia da amônia) (COSTA et al., 2014; MAC CONELL, 2014).