Caracterização das fibras

O teor de celulose, hemicelulose, lignina, cinzas, umidade e extraíveis foram avaliados a partir das fibras in natura (cana-de-açúcar, coco verde e pedúnculo de caju), principalmente objetivando a utilização destes resíduos como substratos indutores na produção de enzimas celulolíticas por FES.

Na etapa de produção de nanocristais de celulose (NCC) utilizou-se o bagaço de cana-de-açúcar, sendo realizado pré-tratamento com NaOH (4% m/v) e Ca(OH)2 (5, 10 e

20% m/v). A caracterização foi realizada segundo o protocolo da NREL (National

Renewable Energy Laboratório - EUA) (SLUITER et al., 2008).

3.2.1. Determinação dos sólidos totais

A metodologia aplicada foi conforme o protocolo da NREL - Determination of

Total Solids in Biomass (SLUITER et al., 2008). Em cápuslas de porcelanas, previamente

taradas, foram pesados cerca de 1,5 gramas de bagaço. A cápusula foi levada para estufa 105 °C por 24 horas. Após esse período, o material então foi colocado em dessecador para efetuar uma nova pesagem. A umidade foi determinada em triplicata e calculada conforme a Equação (3.1).

%𝑼 = (𝟏 − 𝑴𝒔𝒆𝒄𝒂

𝑴ú𝒎𝒊𝒅𝒂) ∗ 𝟏𝟎𝟎 (3.1)

Sendo:

% U = percentual de umidade.

Mseca = massa seca obtida pela diferença entre o peso do conjunto depois da estufa e o

peso da cápsula.

Múmida = massa úmida obtida pela diferença entre o peso do conjunto antes de ser levado

para estufa e o peso da cápsula.

3.2.2. Determinação dos extrativos

Para a determinação dos extrativos utilizou-se o método adaptado da NREL -

Determination of Extractives in Biomass (SLUITER et al., 2008). Assim, foram pesados

utilizando dois solventes em temperaturas diferentes durante 24 horas. Para cada solvente utilizados foram o etanol (95%) a 80 °C e água a 120 °C, ambos com um volume de 70 mL.

Ao final do processo extrativo, o cartucho com o material seco foi colocado em estufa à 100 °C até peso constante. A percentagem de extrativos foi calculada com base na diferença de massa, conforme a Equação (3.2).

%𝑬𝒙𝒕 =𝑴𝒊− 𝑴𝒇

𝑴𝒇 𝟏𝟎𝟎

Sendo:

%Ext: percentual de extrativos.

Mi: massa do cartucho e amostra inicial.

Mf: massa seca do cartucho e amostra após a extração.

3.2.3. Determinação dos polissacarídeos

3.2.3.1. Hidrólise ácida com H2SO4 (72%)

A determinação dos polissacarídeos foi de acordo com protocolo da NREL-

Determination of Structural Carbohydrates and Lignin Biomass (CROCKER et al.,

2008). Uma amostra de aproximadamente de 0,3 g (base seca) foi transferida para um béquer de 100 mL e tratada com 3,0 mL de H2SO4 72%, sob vigorosa agitação, por 60

minutos em um banho com controle de temperatura a 30,0 ± 0,5 °C.

A reação foi interrompida com a adição de 84 mL de água deionizada, sendo a mistura reacional transferida para frascos Erlenmeyers de 500 mL. O Erlenmeyer foi fechado e autoclavado por 15 minutos a 1,05 atm. O frasco foi então retirado e resfriado até a temperatura ambiente. O material hidrolisado foi separado dos sólidos por filtração, utilizando-se papel de filtro seco e tarado. O hidrolisado foi recolhido em um béquers para o recolhimento das frações líquidas destinas à identificação por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), e o sólido contido no papel de filtro foi lavado com porções de 50 mL de água destilada para a retirada dos sulfatos, em seguida foram secos em estufa.

3.2.4. Determinação da lignina

3.2.4.1. Determinação da lignina insolúvel

O material retido no papel de filtro, após a hidrólise ácida, que corresponde à lignina insolúvel, foi submetido a uma lavagem com água destilada até isenção de sulfatos (aproximadamente 1500 mL) e seco em estufa à 50 °C. Por diferença de massa, foi determinado o teor de lignina insolúvel e inorgânico (cinzas). Para se obter o teor de lignina insolúvel real foi necessário se determinar as cinzas do material que ficou retido no papel de filtro.

3.2.4.2. Determinação do teor de cinzas da lignina insolúvel e cinzas totais

Após a determinação da lignina insolúvel em meio ácido (item 3.2.4.1), o resíduo no papel de filtro foi transferido para um cadinho de porcelana previamente tarado. A amostra foi calcinada lentamente até 300 °C, em seguida, por mais duas horas à 800 °C, em mufla.

Para a determinação das cinzas totais seguiu-se a metodologia proposta em NREL

- Determination of Ash in Biomass (TEMPLETON et al., 2008). Nesse caso, foi pesado

aproximadamente 2 g do bagaço em cadinho de porcelana previamente tarado. O material foi calcinado em mufla à 300 °C e logo, em seguida, à 800 °C por duas horas. Por diferença de peso de massa, o teor de cinzas da lignina insolúvel e das cinzas totais foi determinado de acordo com a Equação(3.3).

%𝐜𝐢𝐧𝐳𝐚𝐬 =𝐌𝐜

𝐌𝐚𝐱𝟏𝟎𝟎

Sendo:

% cinzas = percentual em massa de cinzas.

Mc = massa de cinzas (diferença entre massa do cadinho com cinzas e a massa do cadinho

vazio).

Ma = massa da amostra seca (base seca).

3.2.5. Análise do hidrolisado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

A determinação dos teores de celulose e de hemicelulose depende das concentrações de carboidratos e de ácidos orgânicos presentes no hidrolisado após a hidrólise ácida. Os fatores de conversão que foram usados para converter as massas destes compostos em massas de celulose e hemicelulose são apresentados na Tabela 3.1. (PITARELO, 2007)

A análise dos carboidratos e ácidos orgânicos foi realizada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) acoplado a um detector de índice de refração- IR utilizando a coluna Shim-Pack SCR-101H (Shimadzu Co. Japan) com a uma temperatura de 65 °C, e utilizada como fase móvel constituída de uma solução de ácido sulfúrico 0,005 M sob fluxo de 0,6 mL/min. O volume de injeção na coluna foi de 20 µL. As amostras foram previamente filtradas em membranas de 0,22 µm, para remoção de possíveis partículas insolúveis. As concentrações de cada componente foram obtidas através de curvas de calibração que correlacionam às concentrações dos padrões preparados com as respectivas áreas dos cromatogramas.

Tabela 3.1 - Tabela de caracterização e os fatores de conversão de cada componente presente no extrato hidrolisado.