L’identification de protéines à partir d’un extrait cellulaire peut être obtenue au
moyen de diverses techniques biochimiques telles le Western blotting et
l’immunoprécipitation. Le Western blotting consiste à identifier la présence de protéines qui
ont été transférées sur un support de nitrocellulose suite à une électrophorèse sur gel de
polyacrylamide. La feuille de nitrocellulose sera ensuite soumise à une procédure
d’immunomarquage proche de celle décrite en immunohistochimie, permettant de révéler la
protéine d’intérêt grâce à un substrat enzymatique permettant de révéler la protéine ciblée.
■ Préparation des immunobilles
Protéines G / Sépharose IgG
■ Immunoprécipitation
Gel d’électrophorèse
Révélation radiographique
Figure III. 6 ; Présentation schématique des différentes étapes d’immunoprécipitation. L’immunoprécipitation tire avantage
de l’affinité de la protéine G ou A (protéine du Staphylocoque) pour le fragment Fc des immunoglobulines (IgG) de
mammifères. Ces protéines sont conjuguées à des macromolécules d’agarose ou de sépharose précipitables par
centrifugation. La préparation d’immunobilles (complexes protéineG-sépharose-IgG) permet, à partir d’un extrait cellulaire
dont toutes les protéines ont été marquées radioactivement, d’isoler une protéine d’intérêt. Après avoir été détachée des
immunobilles par un tampon dénaturant, les protéines reconnues seront déposées sur un gel de polyacrylamide et soumises à
une électrophorèse. La présence de la protéine pourra ensuite être révélée à partir de ce gel, par une autoradiographie.
Matériel et méthodes 61
La technique d’immunoprécipitation permet d’isoler une protéine d’intérêt à partir
d’un extrait cellulaire dont toutes les protéines ont été marquées radioactivement. Le principe
de cette technique est schématisé dans la Figure III.6. L’immunoprécipitation tire avantage
de l’affinité de la protéine G ou A (protéine du Staphylocoque) pour le fragment Fe des
immunoglobulines (IgG) de mammifères. Ces protéines peuvent être conjuguées à des
macromolécules d’agarose ou de sépharose qui peuvent être précipitées par centrifugation.
En utilisant un anticorps approprié, il est donc possible d’isoler une protéine qui sera ensuite
révélée, après électrophorèse, par une autoradiographie. De plus, l’immunoprécipitation
permet de quantifier le taux d’expression d’une protéine, car c’est au cours de la synthèse
protéique que les protéines ont été marquées, par l’incorporation d’acides aminés couplés à
une substance radioactive telle le le ou encore le ’‘*C. De plus, cette méthode
permet d’identifier la protéine d’intérêt sous sa forme native car la sélection de la protéine a
lieu avant la procédure d’électrophorèse, qui nécessite une dénaturation des protéines. Cette
particularité permet notamment de révéler, par un processus de coprécipitation, des protéines
qui peuvent interagir de manière intime avec la protéine cible, ce qui nous a particulièrement
intéressés dans l’étude des intégrines. En effet les anticorps utilisés pour étudier les
intégrines sont dirigés en général contre un épitope d’une des deux sous-unités alpha ou beta
de cette protéine. L’analyse de protéines coprécipitées nous permet donc d’obtenir un indice
quant à l’association de telle ou telle sous-unité avec une autre au sein de notre extrait
cellulaire. Notre choix s’est donc porté sur cette méthode pour caractériser l’expression in
vitro de diverses sous-unités d’intégrines par les cellules cancéreuses rénales.
La procédure d’immunoprécipitation utilisée dans nos expériences est détaillée ci-
après et se réfère à celle décrite par Cheresh et Spiro pour détecter l’expression d’intégrines
in vitro (1987). Le marquage radioactif des protéines cellulaires a été réalisé à partir de tapis
cellulaires à subconfluence. Après avoir été rincées au PBS (pH7.4) les cellules sont mises
en présence d’un milieu dépourvu de méthionine et de cystéine (DMEM sans méthionine et
cystéine, ICN). L’incubation des cellules pendant une heure (à 37°C avec 5% CO
2) dans ce
milieu a pour conséquence de bloquer transitoirement la synthèse des protéines. Ce même
milieu sera ensuite complété par une solution contenant de la méthionine et de la cystéine
marquées au (lOOpCi/ml de TRAN^^S-LABEL, ICN). L’incorporation des acides aminés
radioactifs au cours de la synthèse protéique est réalisée pendant 5 heures à 37°C. Les boîtes
de cultures sont ensuite rincées à trois reprises avec du PBS à 4°C. Un tampon de lyse RIPA
est appliqué sur le tapis cellulaire pendant 5 minutes. Ce tampon se compose de :
• 0.1 M Tris HCl (SIGMA), pH 7.4,
• O.lSMNaCl,
• 1 mM phényl-methylsulfonyl fluoride (PMSF, SIGMA)
• 0.1% sodium dodecylsulfate (SDS, SIGMA)
• ImM d’acide éthylène diaminetétraacétique (EDTA, SIGMA)
• I % Triton X-100 (SIGMA),
• 0.5% aprotinine (Calbiochem),
• 0.5% sodium deoxycholate (SIGMA).
Le lysat cellulaire obtenu est ensuite récupéré dans un tube de type Eppendorf puis
centrifugé à 3000g pendant 30 minutes afin d’éliminer les débris cellulaires volumineux. Les
macromolécules d’ADN sont solubilisées à la seringue {Microlance i 26 G , 0.45x10,
Becton Dickinson) par une série de va-et-vient successifs. Toutes les étapes de la
préparation des lysats cellulaires sont réalisées sur glace, pour minimiser la dégradation
protéique. La quantité totale d’acides aminés soufrés dans les protéines sera évaluée par une
mesure de la radioactivité émise par un échantillon de 5 pl d’extrait cellulaire pendant 3
minutes. Cette mesure permet d’ajuster le volume de lysat requis pour analyser des
échantillons contenant une quantité similaire de protéines totales avant
l’immunoprécipitation.
Pour chaque échantillon, 40 pl de billes de sépharose couplée à la protéine G {Protein
G Sepharose 4 Fast Flow, Pharmacia Biotech) sont préparées dans un tube de type
Eppendorf. Un volume de 500pl de lysat cellulaire purifié est déposé sur ces billes ainsi que
l’anticorps spécifique de Tintégrine recherchée (voir Table III.5).
Table III.5 ; Anticorps monoclonaux utilisés pour détecter le taux d’expression de diverses
sous-unités d’intégrines dans les adénocarcinomes rénaux in vitro par la technique
d’immunoprécipitation.
Anticorps primaire Firme Concentration
mouse monoclonal anti-intégrine alplta-2 Gibco 1 ; 500
mouse monoclonal anti-intégrine alplia-3 Gibco 1 : 500
mouse monoclonal anti-intégrine alplia-6 Sérotec 1 : 200
mouse monoclonal anti-intégrine beta-1 Gibco 1 : 500
mouse monoclonal anti-intégrine beta-4 Gibco 1 : 200
mouse monoclonal anti-intégrine alpha-v/beta-3 Gibco 1 : 200
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Ce mélange est incubé pendant 2 heures à 4°C sur un portoir rotatif. Les tubes sont alors
centrifugés (1200 g, pendant 1 minute), ce qui permet de précipiter le complexe
billes-anticorps-protéines. Afin d’éliminer au maximum les protéines qui ont pu se fixer de
manière aspécifique sur les immunobilles, divers lavages plus ou moins stringeants sont
réalisés. Pour ce faire, après avoir éliminé le surnageant, le précipité est solubilisé dans 500
pl de PBS 0,1% Triton X-100 et soumis de nouveau à une centrifugation. Le même
processus est réalisé ensuite avec 500pl de PBS 0.5 M NaCl et le dernier lavage est réalisé
avec 500pl de PBS. Les complexes précipités sont alors mis en suspension dans 40 pl d’un
tampon d’échantillon (Laemmi Buffer, concentré 2 x) qui se compose de :
• 62.5 mM Tris HCl, pH6.8
• 2% SDS (SIGMA)
• 10% glycérol (SIGMA)
• Bleu de bromophénol (SIGMA)
• beta-mercapto éthanol 5% (uniquement pour la condition réductrice)
Ce tampon a pour effet de détacher l’ensemble des constituants du complexe précipité. Après
centrifugation, nous pouvons ainsi récupérer le surnageant qui contient l’ensemble des
protéines (ainsi que les immunoglobulines) qui ont été retenues à ce complexe. Ces
échantillons sont alors dénaturés dans un bain-marie à 100°C pendant 3 minutes et avant
d’être déposés sur gel de polyacrylamide. Pour obtenir une séparation optimale des protéines
d’intérêt (dans notre cas, les intégrines) nous avons réalisé des gels composés de 7.5% de
polyacrylamide (solution Acrymamide/Bis 30%, BIORAD) selon la procédure
recommandée. Après dépôt des échantillons, l’électrophorèse a été réalisée dans un tampon
de migration composé de :
• 25 mM Tris
• 250mM glycine pH 8.3 (SIGMA)
• 0.1% SDS
L’appareil d’électrophorèse utilisé est le Mini Protean II Cell de chez BIORAD. Après une
électrophorèse de 1 heure à 120 volts {Power Pac 300, BIORAD), le gel est fixé pendant 30
minutes dans une solution contenant 10% d’acide acétique (Aldrich) et 40% de méthanol.
Après réhydratation du gel dans une solution composée de 10% d’acide acétique et de 5% de
glycérol, le gel est séché sur un papier Wathmann, grâce à un sécheur de gel (BIORAD)
couplé à une pompe à eau (BIORAD). Ce séchage est obtenu en 1 heure à 80°C.
Le gel séché est alors transféré dans une cassette d’autoradiographie (Amersham Life
Science), en présence d’un film autoradiographique {Hyperfilm TM MP, Amersham Life
Science). Le développement de ce film est réalisé de manière automatisée {CURIX 60, Agfa),
après 4 jours d’exposition. Ce temps a été augmenté dans certains cas où la protéine était
trop faiblement exprimée pour être détectable après 4 jours (voir chapitre Résultats).
L’identification des protéines à été permise en comparant le taux de migration des
protéines marquées radioactivement selon leur poids moléculaire (exprimé en kilo Dalton).
par rapport à des marqueurs de poids moléculaires standards prémarqués {Kaléidoscope
Prestained Standards, BIORAD).
Au cours de chacune des expériences d’immunoprécipitation, nous avons utilisé un
échantillon de lysat cellulaire provenant d’une lignée contrôle dont on sait qu’elle exprime la
protéine recherchée. Les différentes lignées utilisées comme contrôles positifs dans l’étude
des intégrines sont reprises dans la Table IV. 14 du chapitre Résultats. Un contrôle négatif
est également nécessaire à l’identification spécifique des protéines. Il s’agit d’un échantillon
de la lignée contrôle appliqué, en absence de l’anticorps, sur des billes de G-sépharose et
soumis à l’ensemble des étapes précitées. Systématiquement, le contrôle négatif présentait
une à 3 bandes aspécifiques situées aux environ de 80 kD. Il s’agit donc de protéines
radioactives qui se sont liées de manière non spécifique aux billes de G-sépharose. Le poids
de ces protéines étant inférieur à celui des protéines recherchées, il n’y a pas eu de problème
d’interprétation du à ce signal aspécifique.
No documento
Avaliação de opções financeiras implícitas em contratos de seguro do ramo vida
(páginas 122-128)