4. MATERIAL E MÉTODOS
4.4. Caracterização dos concentrados proteicos de arroz
4.4.1. Perfil de massas molares - SDS-PAGE
A distribuição da massa molar dos concentrados proteicos de orizenina foi estudada por eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de dodecil sulfato de sódio (SDS–PAGE). Foi utilizado o método vertical com placas de 10x10 cm, descontínuo de alta resolução em SDS–PAGE, descrito por LAEMMLI (1970) e modificado por FULLINGTON, COLE e KASARDA, (1983) empregando-se gel de empilhamento (“stacking gel”) de poliacrilamida a 4 % (m/v) e gel de fracionamento (“running gel”) de poliacrilamida a 1η % (m/v). A eletroforese foi conduzida a tensão constante de 200 V. Os padrões de baixa massa molar utilizados fazem parte do kit Amersham (GE Healthcare) de calibração de baixa massa molar (14 kDa a 97 kDa). A coloração dos géis foi feita com Comassie Blue.
4.4.2. Solubilidade
Os concentrados proteicos de orizenina obtidos pelos protocolos ES (CES) e RA (CRA) (3 g) foram suspensos em 100 mL de água deionizada. O pH foi ajustado e mantido em 2,0; 3,0;4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 ou 9,0, com soluções de HCl 1 mol·L-1 ou NaOH 1,0 mol·L-1. As soluções foram agitadas em temperatura ambiente por 24 h e em seguida centrifugadas a 10 000 x g por 20 minutos. Os sobrenadantes foram filtrados em filtro de seringa com poro de 0,4η μm Merck Milipore (Darmstadt, Alemanha) e o teor de proteínas determinados pelo método da reação de Biureto (GORNALL; BARDAWILL; DAVID, 1949), utilizando uma curva analítica obtida com albumina de soro bovino nas concentrações aquosas de 1,0 mg·mL- 1 a 10,0 mg·mL-1. A leitura
da absorbância foi realizada a 540 nm em espectrofotômetro (SHIMADZU, UVmini1240, Japão), sendo, portanto, a concentração de proteína determinada para cada concentrado proteico usando a equação de regressão da curva analítica.
4.4.3. Propriedades interfaciais
Os concentrados proteicos de orizenina CES e CRA foram diluídos em 100 mL de água destilada de modo a preparar uma solução com 5,7 mg e 7,5 mg de proteína solúvel, respectivamente. O pH foi ajustado para extremo ácido (2,0), ponto isoelétrico da orizenina (4,8) e extremo básico (9,0) e foram submetidos ao processo de sonicação por 80 segundos a uma potência de 24 W no desruptor de células ultrassônico (Fisher Scientific, modelo 120, Pittsburgh, EUA). Água destilada, soluções sonicadas e não sonicadas tiveram sua tensão interfacial (óleo/solução proteica) medida usando o método da gota pendente no tensiômetro DSA100 Kruss (Hamburg, Alemanha) por 3600 segundos.
O modelo matemático (Equação 1) foi ajustado aos dados experimentais que descrevem a cinética de adsorção das proteínas na interface e a queda da tensão interfacial:
� = � + � ∙ −� (Eq. 1) Em que eq é a tensão interfacial no equilíbrio, κ1 e κ2 (min.-1) são a taxa de adsorção e a constante de decaimento da tensão na interface, respectivamente.
A avaliação do modelo ajustado foi feita por meio do coeficiente de determinação (R2) e da estimativa do erro percentual absoluto médio (MAPE) (Eq. 2):
���� = ∑| � −�̂ /� |× , � ≠ (Eq. 2)
Em que onde yt é o valor real, ŷt é o valor ajustado, e n é igual ao número de observações.
4.4.4. Propriedades emulsificantes
Preparação das emulsões
Os concentrados proteicos de orizenina CES e CRA foram diluídos em 100 mL de água destilada de modo a preparar uma solução com 5,7 mg e 7,5 mg de proteína solúvel, respectivamente. O pH foi ajustado para extremo ácido (2,0), ponto isoelétrico da orizenina (4,8) e extremo básico (9,0) e foi mantido sob agitação constante por 24 h a temperatura ambiente. Após a agitação as soluções foram submetidas ou não a sonicação por 80 segundos a uma potência de 24 W. Adicionou-se óleo de girassol (10 % v/v) com 0,05 % de corante Sudan Black foi adicionado e misturados em homogeneizador Ultra Turrax (Yellow line DI25 basic, IKA, Staufen, Alemanha) a 24 000 rpm por 15 minutos em banho de gelo. Imediatamente após o processo de homogeneização, alíquotas de emulsão foram transferidas para tubos de ensaio (Ø = 1,5 cm).
Avaliação macroscópica: índice de cremeação
até completar 24 h. O percentual do índice de cremeação (IC %) foi reportado como (Equação 3):
�� % = × ���� (Eq. 3)
Em que AI é a altura da fase separada e AT é a altura total da emulsão. O modelo matemático foi ajustado aos dados experimentais que descrevem a cinética da cremeação da emulsão (Eq. 4):
�� % = �� − − (Eq. 4) Em que ICeq é o índice de cremeação no equilíbrio e κ constante relacionada a velocidade de cremeação.
A avaliação dos modelos ajustados foi feita por meio do coeficiente de determinação (R2) e do erro percentual absoluto médio (MAPE).
Avaliação microscópica: tamanho médio das gotículas e polidispersidade
As análises microscópicas das emulsões foram realizadas em microscópio óptico Olympus modelo BX50 (Tóquio, Japão), em que uma alíquota da emulsão foi colocada em lâmina, coberta com lamínula e visualizada com um aumento de 400 x e 1000 x. As imagens foram obtidas no dia do preparo das emulsões. Todas as medidas foram realizadas a temperatura ambiente após 1h. Quatro imagens de cada emulsão foram
analisadas com o auxílio do software Image J 1.50b
(HTTP://rsb.info.nih.gov/ij/), as fotografias foram primeiramente convertidas para imagens em escala de cinza 8-bit de 640-480 pixels, apresentando níveis
de cinza entre 0 e 255. O tamanho das gotas foi caracterizado em termos do diâmetro médio superficial d32 e o desvio padrão (Equação 5),
= ∑ �∑ ± √∑( �−−̅ ) (Eq. 5)
em que n é o número de partículas com diâmetro d.
4.4.5. Propriedades espumantes
Os concentrados proteicos de orizenina CES e CRA foram diluídos em 100 mL de água destilada de modo a preparar uma solução com 5,7 mg e 7,5 mg de proteína solúvel, respectivamente. O pH foi ajustado para extremo ácido (2,0), ponto isoelétrico da orizenina (4,8) e extremo básico (9,0) e as soluções foram mantidas sob agitação constante por 24 h em temperatura ambiente. Após a agitação as alíquotas de 25 mL foram submetidas ou não a sonicação por 80 segundos a uma potência de 24 W. Em seguida foram homogeneizadas em homogeneizador Ultra Turrax por um minuto a 20 500 rpm e fotografadas.
A densidade (ρe) de cada espuma foi determinada pela razão massa e volume (g·cm-3); a fração volumétrica de ar (ϕ) foi calculada de acordo com a equação 6, baseada na densidade calculada anteriormente e na densidade da solução proteica (�� e considerando que a densidade do ar é desprezível; a porcentagem de expansão da espuma (overrun) foi calculada de acordo com a equação 7 (FRANCO et al., 2015).
� = −�� (Eq. 6)
% = (� −�) �
Em que ϕ é a fração volumétrica de ar, ρl é a densidade da solução e ρe é a densidade da espuma.
4.5. Elaboração e avaliação de pães isentos de glúten formulados com