Caracterização dos materiais

A amostra de GG conforme fornecida pelo fabricante e os compósitos liofilizados foram caracterizados através das técnicas de Termogravimetria (TGA), Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC), espectroscopia de absorção na região do infravermelho (FTIR) e Difração de raios X (DRX). A TGA e o DSC visaram caracterizar o comportamento térmico desses materiais; a espectroscopia foi feita a fim de verificar a presença das bandas características de todos os compostos preparados; e o DRX teve por objetivo a identificação de possíveis fases cristalinas formadas com a inserção de cálcio na amostra, bem como a averiguação do caráter amorfo do polímero e do vidro, característica importante para o processo de infiltração celular em um scaffold. Os híbridos a base de VB e GG, por sua vez, foram caracterizados por técnicas adicionais de inspeção visual para avaliação da homogeneidade do sistema, observação se houve segregação de fases e averiguação da presença de porosidade. Essas amostras também foram caracterizadas através da microscopia eletrônica de varredura (MEV), acoplada a espectroscopia de energia dispersiva de elétrons (EDS), para fornecer informações quanto a composição química.

Para avaliação do possível comportamento dos compósitos em meio fisiológico foram realizados ensaios degradação e intumescimento em meio aquoso; e foi analisado o comportamento dos materiais após imersão em Simulated Body Fluid (SBF).

• Análise visual

O aspecto macroscópico das amostras foi realizado por meio de análise visual e registro através de câmera fotográfica digital (LG H818P G4) com resolução de imagem de 13MP, para identificação de fases segregadas, bem como existência de porosidades.

• Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) acoplado a Espectrometria de Energia Dispersiva (EDS)

A microscopia eletrônica de varredura foi aplicada para avaliação da morfologia, e presença de poros compatíveis a regeneração óssea. Foi utilizado o equipamento da marca Shimadzu, modelo SSX-550 acoplado ao Espectrômetro de Energia Dispersiva (EDS), utilizado para análise da composição química da superfície das amostras. Para esse ensaio, cada hibrido teve uma amostra retirada do bulk do material. Após o período de imersão em SBF as amostras foram novamente analisadas no EDS para verificar a troca iônica com a solução. Antes de

todos os ensaios as amostras foram metalizadas com ouro para obtenção de uma superfície condutora.

• Termogravimetria (TGA)

A GG e híbridos foram analisados termicamente através do ensaio de termogravimetria. Para a obtenção da curva de variação de massa de acordo com o aumento da temperatura pelo ensaio TGA. Foi utilizado o equipamento SII EXSTAR, modelo TG/DTA 7200. Os parâmetros de ensaio foram: atmosfera dinâmica de nitrogênio com vazão de 90mL.min-1, taxa de aquecimento igual a 10°C min-1, em suporte de alumínio, com faixa de temperatura variando de 10°C a 900°C.

• Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)

Os materiais, GG e híbridos, foram analisada termicamente através da Calorimetria Exploratória Diferencial. Foi utilizado o equipamento da marca SII EXSTAR, modelo DSC 7020 em atmosfera dinâmica de nitrogênio com vazão de 90mL.min-1_{, taxa de aquecimento de} 10°C min-1_{, com massa aproximada de 2mg em suporte de alumínio, com faixa de} temperatura variando de 30°C a 500°C.

• Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourrier (FTIR)

Para identificar os principais grupos químicos presentes no polímero e nos híbridos, associando-os às bandas de vibração evidenciadas nos espectros normalizados obtidos na região do infravermelho, a goma gelana e os híbridos foram analisados através da técnica de obtenção dos espectros de FTIR. Foi adotada a técnica de reflexão transmitida atenuada (ATR), utilizando o espectrofotômetro Nicolet Thermo Scientific 280 com cristal de seleneto de zinco (ZnSe) do Departamento de Química do Centro Federal de Educação Tecnológica de Minas Gerais. O ensaio foi conduzido na faixa espectral de 400cm-1 a 4000cm-1, com resolução de 4cm-1 _{e intervalo de 2cm}-1_.

• Difratometria de raios X

Os parâmetros de cristalinidade da goma gelana, e dos híbridos, foram calculados por meio da análise do difratograma de raios X. Os picos presentes no difratograma foram identificados e o grau de cristalinidade calculado de acordo com a equação 11 a seguir. Nela, GC é o grau de

cristalinidade, AP é a área abaixo dos picos identificados até a sua linha de base, e AT é a área total abaixo do difratograma até a sua linha de base.

GC =AP

AT× 100

(11)

No preparo dos híbridos para o ensaio, as amostras foram cortadas com 1mm de espessura e prensadas de modo a obter uma lâmina em torno de 100µm (COSTA, 2008). Os difratogramas foram obtidos no equipamento SHIMADZU XRD 7000. A radiação utilizada foi CuKα (λ=1,54Å), operando com 40kV, 20mA e ângulo 2θ variando de 4° a 80°, com um passo de 0,02°.

• Degradação e intumescimento em meio aquoso

Seguindo o protocolo adotado por Oréfice (2000), os híbridos foram imersos em água destilada pelo período de 1, 3, 10, e 20 dias. Decorrido cada intervalo de tempo, as amostras foram secas e analisadas por EDS para identificar as trocas iônicas ocorridas com o meio. Nesses intervalos, as massas também foram aferidas para construção de uma curva de variação de massa com o aumento gradual da temperatura (massa x temperatura), de forma a tentar obter informações sobre a degradação do híbrido, em condição mais próxima daquela observada in vivo.

A determinação do grau de intumescimento das amostras foi utilizada para avaliar o perfil de hidratação dos híbridos. Inicialmente, as amostras foram secas em dessecador por 72h e pesadas (M0). Posteriormente, foram imersas em água DI sob temperatura ambiente, obedecendo a relação entre área superficial e volume de solução igual à 0,1cm-1 _(ORÉFICE, 2000). As amostras foram pesadas novamente após imersão pelos períodos de 1, 3, 10 e 20 dias. Foram feitas duas pesagens, a primeira após remoção do excesso de água superficial com um papel absorvente para determinação do intumescimento da amostra (Mi); e a segunda após secagem da amostra em dessecador por 72h. O grau de intumescimento (GI) da amostra é dado em porcentagem através da equação 12. A degradação foi analisada após expressão dos dados em um gráfico de perda de massa com o tempo.

GI =Mi− Mo Mo

× 100 (12)

• Avaliação após Imersão em SBF

Os híbridos foram imersos em solução simuladora do fluido biológico (Simulated Body Fluid) pelo período de 3 dias, seguindo a relação entre área e volume de líquido igual a 0,1cm-1. (ORÉFICE, 2000). Decorrido o intervalo de tempo, as amostras foram secas em dessecador por 72h e analisadas por EDS para identificar as trocas iônicas ocorridas com o meio.

4. RESULTADOS

Aspecto macroscópico e microscópico dos compósitos

Durante o preparo da suspensão de goma gelana, foi constatado que essa mistura, mesmo em pequenas concentrações, possui alta viscosidade que dificulta a dispersão com o sol do vidro. O aumento da temperatura tendeu a reduzir a viscosidade da suspensão de goma, no entanto, a temperatura é catalizador do processo de geleificação do vidro impedindo que ele se misture adequadamente. Adicionalmente, pHs baixos levaram à geleificação da goma antes que a solução de vidro pudesse ser encorporada à mistura. De forma análoga, a mistura com a solução do vidro que é ácida (pH=2) também ocasionou a rápida geleificação do sistema coma goma. As muitas variáveis envolvidas na rota de formação do compósito formaram uma janela de processamento estreita pela qual ambos os materiais poderiam ser unidos com o objetivo de formar um compósito homogêneo. Por essa razão, esforços iniciais de definição da rota de processamento levaram ao preparo da suspersão de goma gelana em pH neutro que somente foi acidificada quando em contato com a solução ácida do VB. Foi observado que a geleificação da mistura ocorreu em aproximadamente 5 segundos. Durante esse tempo, foi feita a agitação vigorosa do sistema com o objetivo de unir os materiais de forma homogênea.

A imersão dos compósitos em solução de CaCl2 teve o objetivo de induzir reticulações químicas na goma gelana tornando-a mais resistente, e também introduzir íons de Ca na estrutura do vidro bioativo que comumente é formado com frações significativas de óxido de cálcio (CaO). Contudo, quando os cátions Ca2+ se ligam à goma gelana a mobilidade das cadeias é reduzida. Por isso, a diminuição da temperatura foi aplicada na tentativa de reduzir a cinética dessas reações de reticulação evitando que ela ocorresse apenas na superfície externa do material. Dessa maneira acredita-se que o material obtido possui estrutura mais homogênea.

Após a formação do gel, os compósitos apresentaram formato cilíndrico semelhante ao do recipiente em que o gel foi formado. Visualmente o gel apresentou-se íntegro, sem defeitos como fissuras ou heterogeneicidades em seu interior; com rugosidades externas possivelmente associados as ligações cruzadas que ocorreram entre a goma gelana e o cálcio. O compósito, no entanto, obteve contração volumétrica após a secagem e liofilização.

A Figura 6 mostra compósitos esponjosos com camada externa mais compacta, indicando maior densidade de reticulações, sugestivo do contato imediato com os íons Ca2+ da solução de imersão. Por essa camada exterior não possuir as mesmas características do buck do material, ela foi retirada antes que fossem realizadas as demais caracterizações das espumas. Também é possível observar rugosidades, especialmente visíveis das laterais da espuma, que evidenciam a contração volumétrica sofrida no processo de secagem. Os moldes possuem 50mm de diâmetro, e as espumas obtiveram diâmetro final de 40mm. Visualmente, não houveram evidências de segregação se fases. A Figura 6 também exibe as espumas em corte transversal mostrando a sua estrutura porosa.

Figura 6 - Imagem macroscópica e microscópica dos híbridos

Amostras de híbridos com a) 70%, b) 80% e c) 83% de VB após liofilização. Vista da superfícial e em corte transversal. Fonte: da autora.

A elevada viscosidade da suspensão de goma gelana mesmo em baixas concentrações fez com que as proporções em massa dos componentes VB e GG nos hibridos fossem 3:1 (75VB), 4:1(80VB) e 5:1(83VB) respectivamente. Dessa forma, há predominância do vidro em relação à goma gelana nos compósitos. Entretanto, mesmo pequenas quantidades de goma demonstraram serem benéficas na redução da fragilidade do vidro logo após a liofilização. O compósito 83VB apresentou-se mais duro que os demais e com formação de pó que indicava pequenas partículas que se desprenderam da estrutura quando essa foi submetida à pressão no processo de secagem. Ao passo que a amostra 75VB, com maior fração polimérica, estava mais maleável à pressão quando compactada entre os dedos e com ausência ou menor

liberação de fragmentos particulados após a secagem. Entretanto, em inspeção visual, todas as estruturas estavam intactas, sem fraturas ou trincas.

Figura 7 – Imagens de MEV dos híbridos

Imagem de MEV em ampliação de 400x (coluna da esquerda) e 800x (coluna da direitra). As linhas correspondem às amostras a)75VB, b)80VB e c) 83VB. Fonte: da autora.

A Figura 7 é construída com as imagens obtidas na microscopia eletrônica de varredura, com aumentos de 40x e 800x. Nessas imagens é possível observar que não houve segregação de fases visíveis nesses aumentos. A boa mistura entre os componentes dos compósitos é importante para assegurar o efeito sinérgico entre as propriedades físico químicas e mecânicas de cada componente.

A presença de rugosidades nas imagens, visíveis da coluna direita (Figura 7), são características de contração de polimérica. Aliado ao fato de a espuma ter visivelmente reduzido o seu volume em relação as dimensões do gel, essas rugosidades evidenciam o fenômeno de contração que ocorreu durante a liofilização dos compósitos.

Quando não há infiltração de cálcio na goma gelana, esta tende a apresentar morfologia fusiforme; quando essa infiltração ocorre, no entanto, a morfologia tende a ser lamelar (CORREA, 2018). Nas imagens da Figura 7 é possível perceber a presença de estruturas lamelares do polímero, sugerindo que houve reticulação polimérica. Esse resultado indica que a redução da temperatura no processo de imersão dos compósitos em solução de CaCl2 foi eficiente em permitir a infiltração de cálcio como era desejado.

Os poros, por sua vez, são formados pela interconexão entre essas lâminas e apresentam-se maiores que 300µm, que é a dimensão mínima de poro recomendada para que haja perfusão de células ósseas durante o crescimento celular.

Termogravimetria (TGA)

Os resultados da análise termogravimétrica são apresentados nas Figuras 8 a 11. Para identificação das temperaturas em que houve perda de massa significativa foi feita a curva derivada da TGA no programa OriginPro8®. As faixas de variação de temperatura e perdas de massa correspondentes estão discriminadas nas tabelas 1 a 4 que acompanham as figuras. Os fenômenos térmicos associados a cada faixa de temperatura também encontram-se evidenciados nas tabelas.

A figura 8 e tabela 1 apresentam os resultados da TGA para a amostra de goma gelana conforme fornecida pelo fabricante (0VB). O material apresentou perda de 8% em sua massa na faixa de temperatura até cerca de 83°C, associado a perda de água. Percebe-se nessa etapa

que a perda de massa ocorreu até aproximadamente 100°C, temperatura característica da evaporação da água, antes que houvesse estabilização da massa durante o aquecimento. Posterior a esse processo de desidratação, a amostra seca resultante apresentou redução de massa de 25% em uma etapa de desidratação, que ocorreu próximo a 256°C; dessa vez, da água adsorvida às moléculas de GG que necessitam de energia um pouco superior para se desprenderem. Posterior redução de 52% ocorreu devido à decomposição térmica. A temperatura de decomposição térmica começou em 256°C. Em seguinda, em 600°C, iniciou- se o estágio de degradação do polímero com redução de 13% na massa. Nesse último estágio de degradação ocorreram reações endotérmicas de oxidação, seguidas por reações exotérmicas de pirólise (MACHADO et al., 2003). Ao final do ensaio restou um resíduo correspondente a 11% da massa seca inicial.

Figura 8 – TGA da GG em pó (0VB) 0 200 400 600 800 0 20 40 60 80 100 600°C 256°C Ma ss a (%) Temperatura (°C) 83°C Fonte: da autora

Tabela 1 – Resultado da TGA da GG em pó (0VB) Evento térmico Temperatura (°C) Perda de massa (%)

Desidratação 25 a 83 8 Desidratação 83 a 256 25 Decomposição térmica da GG 256 a 600 51 Degradação da GG 600 a 800 13 Resíduo final 800 11 Fonte: da autora.

A figura 9 e tabela 2 apresentam os resultados da TGA para o híbrido 75VB. O material apresentou perda de 6% em sua massa em um processo de desidratação. A amostra seca teve então uma redução de 26% associada à desidratação da água adsorvida aos constituintes do híbrido; seguida de redução de 30% devido à decomposição polimérica e de 21% devido à degradação. Ao final do ensaio restou um resíduo correspondente a 23% da massa.

Figura 9 – TGA do híbrido 75VB

0 200 400 600 800 20 40 60 80 100 Ma ss a ( %) Temperatura (°C) 85°C 257°C 458°C Fonte: da autora.

Tabela 2 – Resultado da TGA da amostra 75VB

Evento térmico Temperatura (°C) Perda de massa (%)

Desidratação 25 a 85 6 Desidratação 85 a 257 26 Decomposição 257 a 458 30 Degradação 458 a 800 21 Resíduo final 800 23 Fonte: da autora.

A figura 10 e tabela 3 apresentam os resultados da TGA para o híbrido 80VB. O material apresentou perda de 14% em sua massa em um processo de desidratação. A amostra seca teve então uma redução de 27% associado à desidratação da água adsorvida aos constituintes do híbrido; seguida de redução de 23% devido à decomposição polimérica e de 19% devido à degradação. Ao final do ensaio restou um resíduo correspondente a 31% da massa.

Figura 10 – TGA do híbrido 80VB 0 200 400 600 800 20 40 60 80 100 Ma ss a ( %) Temperatura (°C) 97°C 480°C 251°C Fonte: da autora.

Tabela 3 – Resultado da TGA da amostra 80VB

Evento térmico Temperatura (°C) Perda de massa (%)

Desidratação 25 a 97 14 Desidratação 97 a 251 27 Decomposição 251 a 480 23 Degradação 480 a 800 19 Resíduo final 800 31 Fonte: da autora.

A figura 11 e tabela 4 apresentam os resultados da TGA para o híbrido 83VB. O material apresentou perda de 14% em sua massa em um processo de desidratação. A amostra seca teve então uma redução de 27% associado à desidratação da água adsorvida aos constituintes do híbrido; seguida de redução de 23% devido à decomposição polimérica e de 19% devido à degradação. Ao final do ensaio restou um resíduo correspondente a 31% da massa.

Figura 11 – TGA do híbrido 83VB 0 200 400 600 800 20 40 60 80 100 Ma ss a (%) Temperatura (°C) 100°C 251°C 496°C Fonte: da autora.

Tabela 4 - Resultado da TGA da amostra 83VB

Evento térmico Temperatura (°C) Perda de massa (%)

Desidratação 25 a 100 12 Desidratação 100 a 251 26 Decomposição 251 a 496 29 Degradação 496 a 800 10 Resíduo final 800 35 Fonte: da autora

De forma a comparar os processos térmicos ocorridos nos materiais foi constuída a tabela 5 a seguir, agrupando as informações contidas nas tabelas anteriores (1-4).

Tabela 5 – Comparação do resultado da TGA das amostras

Evento térmico Perda de massa (%) 0VB 75VB 80VB 83VB Desidratação 8 6 14 12 Desidratação 25 26 27 26 Decomposição 51 30 23 29 Degradação 13 21 19 10 Resíduo final 11 23 31 35 Fonte: da autora

A partir da tabela 5 percebe-se que a quantidade inicial de água nos híbridos foi maior nas amostras com maior quantidade de VB, o que evidencia o caráter higroscópico desse material. Mesmo que as amostras tenham sido liofilizadas antes do ensaio, o contato com o ar atmosférico foi suficiente para que novas moléculas de água fossem adsorvidas. No entanto, a água aprisionada na estrutura da espuma correspondeu praticamente à mesma fração em massa em todos os híbridos, e foi semelhante àquela verificada na amostra em pó da GG. Essa característica mostra a eficiência no processo de liofilização das amostras. Evidencia também que a exposição do material à umidade do ar apenas levou à adsorção de moléculas de água, não introduzindo mais moléculas de água na estrutura no material.

A perda de massa na etapa de decomposição polimérica foi reduzida nos híbridos em relação à GG em pó, devido a menor proporção de goma gelana na amostra inicial. A maior variação entre as amostras ocorreu na fase de degradação polimérica e àquelas com menor proporção de goma obtiveram menor perda de massa relativa à degradação do polímero.

No resíduo final restaram os óxidos de silíco, compostos de cálcio e fósforo, e os produtos da combustão dos materiais orgânicos. Considerando somente a massa restante após a perda de água estrutural, adsorvida ao compóstico, percebe-se que as massas percentuais perdidas nos eventos de decomposição e degradação térmica correspondiam a 69%(75VB), 58%(80VB), e 53%(83VB). Essas perdas encontram-se na razão 1,00:0,84:0,76. Essa razão não corresponde a razão de goma presente nas amostras que é 1,00:0,80:0,67 respectivamente. Levando em consideração a amostra 0VB, a razão do resíduo final teórico correspondente a GG seria 1,00:1,35:1,53; que também não corresponde aos valores encontrados nos compósitos. De forma análoga, as massas percentuais mantidas no resíduo final, em relação a massa seca após ambas as etapas de desidratação são 31%(75VB), 42%(80VB), e 47%(83VB). Tomando a amostra 0VB como base de cálculo, sabe-se que aproximadamente 15% da massa seca após as etapas de desidratação é mantida como resíduo da combustão do polímero. Portanto, seria esperado que o percentual do resíduo que corresponderia a 26,5% (75VB), 35,9% (80VB) e 40,1%(83VB) fosse proveniente do vidro, fornecendo a razão 1,00:1,35:1,51 . No entanto, a razão nominal de vidro presente nas amostras que é 1,00:1,06:1,11 respectivamente. Tais razões estão evidenciadas na Tabela 6.

Contudo, a imersão dos compósitos em solução de cloreto de cálcio visou a infiltração desse composto na estrutura da goma, como agente reticulante; e na estrutura do vidro bioativo

como um óxido adicional (CaO). O cálcio, portanto, seria um elemento adicional no resíduo final após a termogramiteria. Essa discrepância entre as razões dos componentes do compósito e a quantidade de resíduos obtidos indica, portanto, a incorporação do cálcio no híbrido. Além disso, as razões calculadas sugerem que o vidro reagiu preferencialmente com o cálcio uma vez que o aumento de 11% na proporção de VB da amostra 75VB para a 83VB gerou um aumento de 52% na razão entre os resíduos do 75VB e 83VB.

Como não foi analisada uma amostra 100VB na termogravimetria, não há como por essa análise termogravimétrica apenas, estipular quanto de cálcio foi absorvido. Mas cálculos adicionais podem ser feitos mostrando que se o resídio inorgânico não incluísse óxido de cálcio – e tomando o resídio inorgânico do 75VB como sendo apenas do vidro bioativo sem óxidos de cálcio – as proporções de VB nas amostras baseadas em seus resíduos deveriam ser aproximadamente 75%, 107% e 122%. Como essas proporções são, na verdade, 75%, 80% e ~83%, esse resultado mostra que o cálcio foi amplamente absorvido nas amostras com maior quantidade de VB.

Tabela 6 - Análise da termogravimetria

75VB 80VB 83VB Razão

Porcentagem de GG 25,0% 20,0% 16,7% 1,00:0,80:0,67

Porcentagem de VB 75,0% 80,0% 83,3% 1,00:1,06:1,11

Perda percentual de massa na decomposição e degradação 69% 58% 53% 1,00:0,84:0,76

Resíduo final 31% 42% 47% 1,00:1,35:1,52

Resíduo final teórico correspondente a GG 4,5% 6,1% 6,9% 1,00:1,35:1,53 Resíduo final teórico correspondente a VB 26,5% 35,9 40,1% 1,00:1,35:1,51 Fonte: da autora

Por fim, é importante ressaltar que não ocorrem nos híbridos eventos térmicos distintos àqueles evidenciados na amostra 0VB uma vez que o vidro é um material cerâmico que sofre alterações térmicas apenas em temperauras muito elevadas, superiores às do ensaio. No entanto, houve deslocamento das curvas quanto à temperatura em que os eventos térmicos ocorreram; indicando que houve interação entre os materiais.

Calorimetria Diferencial Exploratória (DSC)

A calorimetria diferencial exploratória da GG e dos compósitos encontram-se na Figura 12. Na DSC da goma gelana apresentada percebe-se picos endotérmicos em 51°C e 218°C referentes a desidratação do polímero. O pico exotérmico em 247°C pode estar associado à degradação polimérica. Nos híbridos, no entanto, existem um ponto de inflexão próximo a