Os dispositivos ESP e LUV foram avaliados para detecção de HB humana, a fim de estudar a aplicabilidade destes sensores para moléculas biológicas mais complexas. A Figura 30 mostra voltamogramas cíclicos obtidos na presença de HB 10 mg mL1 preparada em solução tampão fosfato 0,2 mol L1,(pH 7,0). Para ESP é possível observar um par de picos redox quase- reversíveis, no qual o catódico apresenta uma melhor definição na corrente de pico. Esse par redox é atribuído ao íon Fe presente dentro do grupo heme da HB, possibilitando visualizar a reação Fe (III) Fe (II) a partir de uma varredura de potenciais. O mesmo não foi observado para LUV, ao qual os pares redox não puderam ser visualizados, concluindo então que dentre os dispositivos, ESP apresenta um comportamento promissor para a detecção dessa molécula e continuará a ser estudado na presença da mesma.
É interessante observar que o ferro apresenta-se no seu estado ferroso normalmente dentro da molécula de HB, porém não foi possível visualizar a reação anódica durante a medida – independente do sentido e varredura utilizado. Esse comportamento pode ser justificado devido às medidas terem sido realizadas em ambiente aeróbico, possibilitando uma interação das moléculas em solução com o oxigênio do ambiente, ocasionando uma mudança na valência do íon antes do início das medidas..
FIGURA 30 - Voltamogramas cíclicos obtidos na presença de HB 10 mg mL1 preparada em solução tampão fosfato 0,2 mol L-1, pH 7,0; v = 10 mV s1 para LUV () e ESP ().
Devido à molécula de hemoglobina ser altamente complexa, contendo o íon condutor dentro de um invólucro proteico denso e hidrofóbico, espera-se, com base da literatura, que a transferência de elétrons seja de forma lenta. Os elétrons que transitam entre o material condutor do eletrodo e o grupo eletroativo, íon ferro, localizado internamente a molécula necessitam vencer a barreira proteica a fim de que a transferência de elétrons seja efetiva. (Hussain et al., 2017) Alguns trabalhos na literatura buscaram compreender o comportamento de HB sobre a eletrodos de carbono utilizando-se de diferentes tipos de superfícies imobilizadoras como filmes de fibroína de seda (Wu et al., 2006) e ovo-fosfatidilcolina, um lipídeo natural (Han et
al., 2002). A finalidade desses trabalhos, no entanto, não buscava a detecção direta de HB, mas
sim sua utilização como mediadora para a detecção de outros compostos como o óxido nítrico e o peróxido de hidrogênio. Até o momento poucos trabalhos foram abordados em literatura buscando desenvolver sensores para detecção direta de hemoglobina –através da atividade do íon Fe - sem modificadores de superfície e/ou facilitadores de transferência eletrônica e, nenhum, até o momento, utilizou sensores descartáveis para essa finalidade. Toh e colaboradores (Toh et al., 2014) realizaram um estudo eletroquímico, utilizando eletrodo de carbono vítreo e voltametria cíclica, a fim de compreender o comportamento do íon ferro presente na hemoglobina, diretamente nas hemácias e no sangue. No trabalho foi possível identificar o pico característico da redução do Fe, também obtido nesse trabalho, bem como a ausência de um pico de oxidação de boa resolução. Os trabalhos que apresentam detecção direta desse analito utilizam outros tipos de processos como microfluídica, amperometria e injeção em fluxo. (Moon et al., 2017)
Avaliaram-se as técnicas de SWV e DPV na presença de HB 2,5 mg mL1 em tampão fosfato 0,2 mol L1, pH 7,0, ao qual a melhor resposta foi obtida para DPV, como já esperado, devido a técnica se aplicar melhor para reações de cinética lenta (Figura 31). Apesar do também aparecimento dos picos na técnica de SWV, os mesmos não apresentaram uma resolução adequada o suficiente, tornando a técnica ineficaz para a detecção do analito. Os estudos foram prosseguidos pela técnica de DPV, através da otimização da velocidade de trabalho nas velocidades de 10, 35 e 50 mV s1. Como esperado, à medida que a velocidade aumentou os
picos foram perdendo definição e, por consequência, perdendo magnitude de corrente, assim, foi definida como velocidade final 10 mV s1. Devido ao caráter biológico da molécula e com
FIGURA 31 - Voltamogramas utilizando as técnicas de (●) SWV e (●) DPV na presença de HB 2,5 mg mL1 em tampão fosfato 0,2 mol L-1(pH 7,0).
A construção da curva analítica foi realizada utilizando DPV na presença de diferentes concentrações de HB, preparadas em solução tampão fosfato 0,2 mol L1, pH 7,0, v= 10 mV s1. A Figura 32 apresenta os voltamogramas e o comportamento linear obtidos para um intervalo de concentrações de HB entre 1,0 e 10 mg mL1. A reta obtida pela curva analítica está indicada na Equação 4, ao qual foi utilizou-se o em relação às concentrações estudadas:
𝐼(𝐴) = 1,48382 × 10−6 − 5,93365 × 10−7𝐶
𝐻𝐵𝑚𝑔 𝑚𝑙−1 Equação 4
FIGURA 32 - (A) Voltamogramas de pulso diferencial obtidos na presença de diferentes concentrações de HB: (1) 1,0 mg mL1; (2) 2,5 mg mL1; (3) 3,5 mg mL1; (4) 5,0 mg mL1;
(5) 7,5 mg mL1; (6) 10 mg mL1, preparadas em solução tampão fosfato 0,2 mol L1, pH 7,0; v= 10 mV s1 e (B) Curva analítica de HB obtida em ESP.
O limite de detecção de ESP para HB foi calculado a partir da equação LOD = 3 × SD
da curva / inclinação da curva a fim de determinar a menor concentração de analito detectável
em uma amostra. O LOD obtido foi de 0,7 mg mL1. Os níveis normais de HB em sangue humano, de acordo com a Organização Mundial da Saúde, são de 130 mg mL1para homens acima dos 15 anos; 120 mg mL1para mulheres não gestantes acima dos 15 anos e; 110 mg mL1para mulheres gestantes. A faixa linear obtida nesse trabalho não atende aos valores normais encontrados devido a problemas na diluição da HB humana aqui utilizada, que apresenta um fator de solubilidade de até 20 mg mL1.
A validação da amostra foi realizada através da metodologia de adição e recuperação em amostras aquosas de hemoglobina humana, utilizando concentrações dentro da curva analítica obtida. Foram obtidas porcentagens de recuperação entre 81,5 e 106 %.
CAPÍTULO
2
DESENVOLVIMENTO DE ELETRODOS DE PLATINA FLEXÍVEIS SOBRE A SUPERFÍCIE DE FOLHAS DE ECOPET CARACTERIZADOS NA PRESENÇA DE DOPAMINA E UTILIZADOS NO DESENVOLVIMENTO DE UM IMUNOSSENSOR PARA DETECÇÃO DA PROTEÍNA PARK7/DJ-1.
RESULTADOS E DISCUSSÃO