Caracterização electroforética: Electroforese em gel de campo pulsado (PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis)

A técnica de PFGE foi desenvolvida, em 1983, por Schwartz & Cantor, com o objectivo de separar os cromossomas de Saccharomyces cerevisiae, com tamanhos moleculares entre 200 - 2200 Kb. A equipa de Schwartz pretendia melhorar a separação de moléculas de DNA de grandes dimensões, ultrapassando desta forma, as limitações que existiam numa electroforese convencial

1 _{Corante Giemsa é constituído por mistura de azur II (mistura equimolar de azur I e azul de metileno) e}

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(Herschleb et al., 2007). Para tal, Schwartz e os seus colaboradores desenvolveram um aparelho com alterações periódicas do campo eléctrico e onde a separação de moléculas de DNA de grandes dimensões, dependia do tempo que as moléculas necessitavam para se reorientarem no gel (Nassonova, 2008).

A metodologia desenvolvida por Schwartz & Cantor foi alvo de várias modificações, da qual resultaram vários aparelhos de electroforese com diferenças na disposição dos eléctrodos e, consequentemente, no ângulo de orientação. A cada aparelho foi atribuído um nome diferente, no entanto, ficou estabelecido que a abreviatura de PFGE seria aplicada a todos os instrumentos em que o princípio do campo pulsado é aplicado. O nome de cada um dos aparelhos é utilizado, dependendo da disposição dos eléctrodos e do ângulo de orientação formado (Anand & Southern, 1990; Nassonova, 2008).

Uma das variantes da metodologia original de Schwartz e Cantor foi desenvolvida por Chu e a sua equipa em 1986, à qual foi atribuída a designação de CHEF (Countour-Clamped Homogeneous Electric Field). Neste aparelho de PFGE, existem eléctrodos dispostos nos lados de um hexágono e dois campos eléctricos que formam um ângulo de 120 º (Fig. 1.8). Estas características são responsáveis pela formação de um campo eléctrico homogéneo ao longo de todo o gel (Nassonova, 2008). Actualmente esta é uma das variantes mais usadas de PFGE (Nassonova, 2008), que permitiu a determinação do tamanho e número de cromossomas de muitos organismos difíceis de estudar através de métodos citológicos (Rodriguez-García et al., 2006).

Na tabela 1.1 são apresentados alguns exemplos de fungos fitopatogénicos em que foi aplicada a técnica de PFGE, para determinar o tamanho do genoma e dos cromossomas dos mesmos.

Fig. 1.8 - Representação da disposição dos

eléctrodos num aparelho de Counter-Clamped Homogeneous Electric Field (CHEF). (Nassonova, 2008).

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Tabela 1.1 - Representação da técnica de Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) em alguns fungos

fitopatogénicos, na determinação do tamanho do genoma e tamanho médio dos cromossomas (adaptado de Lukács et al., 2006). Fungo Planta hospedeira Genoma (Mb) Número de cromossomas/ Tamanho médio dos

cromossomas (Mb)

Alternaria alternata Batateira

Feijoeiro 28,8 - 33,6 9 – 11 / 0,4 - 5,7

Cochliobolus sativus Ervilha

Trigo 33 15 / 1,25 - 3,8

Fusarium oxysporum Tomateiro 26,7 8 / 0,6 - 6,7

Geotrichum candidum Batateira 11 - 19 5 – 8 / 0,6 - 4,5

Plasmodiophora

brassicae Crucíferas 20,3 16 / 0,68 – 2,2 Sclerotinia sclerotiorum Soja, feijão

algodão 43,5 16/1,5 - 4,0

Ustilago hordei Cevada 18,4 - 25,9 16 – 21 / 0,17 - 3,15 Cochliobolus

heterostrophus Milho 50 9 / 2 – 10,3

Na técnica de PFGE, a separação de moléculas de DNA de diferentes tamanhos, depende de vários parâmetros que condicionam a sua mobilidade e separação de acordo com o tamanho molecular (Nassonova, 2008). Os parâmetros são independentes e permitem separar moléculas com tamanhos moleculares inferiores a 1,5 Mb, entre 1,5 - 3,5 Mb e superiores a 3,5 Mb (Rodriguez- García et al., 2006).

O parâmetro mais crítico na separação molecular é o tempo de pulso. Durante este período ocorre a mudança de direcção do campo eléctrico, no qual as moléculas de maiores dimensões necessitam de um tempo maior para mudarem de direcção pois migram mais devagar (Anand & Southern, 1990; Nassonova, 2008).

O ângulo de orientação é outro factor que influencia a separação molecular. O seu valor pode variar entre 90 º - 180 º, no entanto, em alguns aparelhos de PFGE é fixo. O ângulo escolhido influencia a mobilidade das moléculas, uma vez que em moléculas de maiores dimensões a mobilidade aumenta com a diminuição do ângulo (Nassonova, 2008).

Para além destes dois factores, a eficiência da separação de moléculas de DNA, depende de outras condições como a força do campo eléctrico, a temperatura do tampão e a concentração do gel de agarose. No primeiro caso, ao aumentar o seu valor aumenta a mobilidade e migração molecular e diminuindo, aumenta a resolução (Birren et al., 1988; Chu et al., 1990; Mathew et al., 1988). No caso de um campo eléctrico muito elevado (> 10 V/cm) ocorre o aparecimento de arrastamento e no caso de moléculas de grandes dimensões, poderá provocar a sua mobilização no gel e provocar mudanças

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irreversíveis na sua conformação. O campo eléctrico a usar deverá ser mais fraco, ou seja, entre 1 - 3 V/cm (Chu et al., 1990; Gunderson & Chu, 1991; Gurrieri et al., 1999; Mathew et al., 1988).

A migração do DNA no gel também depende da temperatura do tampão utilizado, que em caso de ser muito elevada é responsável por uma maior velocidade de migração. Neste caso as bandas tornam-se difusas e a resolução diminui, podendo acontecer o aparecimento de arrastamentos. Para serem obtidos bons resultados, a temperatura deve ser baixa e tem de estar compreendida entre 12 - 16 ºC. O tampão usado deve ainda ter uma força iónica elevada (0,5x TBE ou Tris acetato - 1x TAE). Por último, a concentração do gel de agarose é outro factor relevante na migração molecular. Ao aumentar o seu valor, ocorre a diminuição da velocidade de migração, sendo necessário aumentar o tempo de corrida. Segundo Mathew e colaboradores (1988) ao testar diferentes concentrações no gel de agarose, foi demonstrado que são obtidos melhores resultados num gel de 1,2 % do que 0,9 %.

A técnica de PFGE constituiu um avanço na caracterização cariológica de fungos filamentosos e leveduras (Schwartz & Cantor, 1984), uma vez que pode ser aplicada a vários fungos, independentemente da fase sexual em que se encontra, permitindo observar os cromossomas no gel e ligeiras diferenças entre estes. As limitações subjacentes a esta técnica estão relacionadas com as bandas obtidas, uma vez que as bandas observadas no gel podem não corresponder a cromossomas intactos. Além desta limitação, a técnica de PFGE não revela características morfológicas, sobre a estrutura dos cromossomas. Para determinar o cariótipo, estas limitações devem ser compensadas com observações citológicas, através da realização de outras técnicas como é o caso do GTBM (Taga & Murata, 1994; Wieloch, 2006).

O uso combinado das técnicas de GTBM e PFGE permite contornar as limitações de cada uma. Os resultados de ambas devem ser analisados e comparados, uma vez que a técnica de GTBM permite distinguir cromossomas com tamanho idêntico, que não podem ser separados por PFGE. Estas duas técnicas são complementares e fornecem informações essenciais, para a cariotipagem de uma espécie (Taga et al., 1998).