Caracterização Estrutural dos Oligossacarídeos Isolados dos LPS de H

seropedicae SmR1 e dos Mutantes RAMEBB e RAMEBC

Após o processo de hidrólise branda dos LPS obtidos nas frações fenólicas de SmR1, RAMEBB e RAMEBC, os oligossacarídeos resultantes foram recuperados como material solúvel após a centrifugação para remoção da porção lipídeo-A. A análise de composição monossacarídica desses oligossacarídeos, obtidos das três estirpes de H. seropedicae, revelou diferenças bastante grandes entre a estirpe selvagem (SmR1) e os mutantes (RAMEBB e RAMEBC). Os cromatogramas na figura 47 mostram os derivados per-O-TMS encontrados nessa análise. Quantidades significativas de Rha foram encontradas para a estirpe SmR1, e, como esperado, ambos os mutantes mostraram-se desprovidos desta unidade monossacarídica. Além desta, unidades de Kdo, Glc, GlcNAc e 4-N-Ara foram encontradas para a estirpe selvagem, uma composição bastante diferente daquela encontrada para os oligossacarídeos dos mutantes que apresentaram grande quantidade de Hep, além de Gal, QuiNAc e Man. De fato, a única similaridade entre a composição encontrada para SmR1 e para os mutantes foi a presença de pequenas quantidades de 4-N-Ara.

FIGURA 47. Cromatogramas dos derivados per-O-TMS obtidos da porção oligossacarídica dos LPS de SmR1 e dos mutantes de H. seropedicae.

Todas as frações oligossacarídicas foram também avaliadas quanto a sua composição utilizando derivados alditol acetato, que revela apenas as unidades neutras, porém com maior confiabilidade. A tabela 20 sumariza a quantificação dos derivados per-O-TMS e alditol acetatos encontrados para os oligossacarídeos de H. seropedicae, estirpes SmR1, RAMEBB e RAMEBC.

TABELA 20. Composição por derivados AA e per-O-TMS dos oligossacarídeos obtidos após hidrólise branda dos LPS de SmR1 e dos mutantes de H.

seropedicae.

per-O-TMS Alditol Acetato

SmR1 RAMEBB RAMEBC SmR1 RAMEBB RAMEBC

Rha 35,9 - - 39,1 - -

4-N-Ara 2,1 7,3 7,6 - - -

Man - 2,8 3,4 - 5,2 7,0

Gal - 24,7 26,6 - 33,0 35,7

QuiNAc - 4,8 5,1 - 3,1 8,7

Glc 27,5 - - 29,9 - -

Hep - 60,5 57,3 - 58,7 48,6

Kdo 6,2 - - - - -

GlcNAc 28,5 - - 31,0 - -

* Valores mostrados em mol% relativo à soma das áreas dos sinais encontrados no GC-MS.

SmR1

Mutantes

A mistura de oligossacarídeos obtida para cada estirpe foi purificada por coluna de gel filtração em Sephacryl S-100 utilizando 50 mM de formato de amônio como eluente como descrito. Após eluição dos oligossacarídeos foram obtidas cinco frações purificadas para cada estirpe. Os perfils de eluição para ambos os mutantes foram praticamente idênticos. As frações I de cada estirpe foram subdivididas em subfrações, sendo três subfrações para SmR1 (A, B e I-C) e duas subfrações para os mutantes (I-A e I-B). A figura 48 mostra o perfil de eluição dos oligossacarídeos de cada estirpe.

FIGURA 48. Perfil cromatográfico em coluna Sephacryl S-100 dos oligossacarídeos obtidos após hidrólise branda dos LPS de SmR1 e do mutante RAMEBB de H. seropedicae (Representativo para o mutante RAMEBC).

As frações II e IV das três estirpes foram selecionadas pelos seus perfis cromatográficos e foram submetidas à derivatização para terem sua composição determinada (TABELA 21). A fração II de SmR1 apresentou Rha, Glc e GlcNAc em sua composição, enquanto que a fração IV desta estirpe apresentou apenas Glc e GlcNAc. Ambas as frações obtidas para cada estirpe mutante apresentaram grande quantidade de Hep em suas composições, além de quantidades significativas de Gal. Interessantemente, a fração II, tanto de RAMEBB quanto de SmR1

Mutantes

RAMEBC mostrou conter QuiNAc, enquanto que a fração IV de ambos os mutantes apresentaram 4-N-Ara em suas composições.

TABELA 21. Derivados per-O-TMS dos oligossacarídeos obtidos após fracionamento em Sephacryl S-100 da porção O-antígeno dos LPS extraídos na fração fenólica das células de SmR1, RAMEBB e RAMEBC.

Frações Oligossacarídicas

SmR1 RAMEBB RAMEBC

II IV II IV II IV

Rha 33,2 - - - - -

4-N-Ara - - - 19,7 - 21,8

Gal - - 26,5 13,9 23,8 10,9

QuiNAc - - 7,2 - 9,2 -

Glc 52,9 84,3 - - - -

Hep - - 66,3 66,4 67,0 67,3

GlcNAc 13,9 15,7 - - - -

* Valores mostrados em mol% relativo à soma das áreas dos sinais encontrados no GC-MS.

Análises por MALDI-TOF em modo positivo foram possíveis somente para as fração II e IV de SmR1 uma vez que os espectros obtidos para as outras frações oligossacarídicas dos mutantes não apresentaram uma resposta adequada. Para a fração II (FIGURA 49) o sinal base foi encontrado em m/z 1750, correspondendo à massa aproximada de um decassacarídeo, sendo sua forma di-sodiada encontrada em m/z 1772. Foi possível observar uma possível fosforilação desse oligossacarídeo, uma vez que foram encontrados sinais em m/z 1830 e m/z 1670 com diferenças correspondentes à adição e subtração destes substituíntes (m/z 80) respectivamente. O sinal em m/z 1708 sugere também a presença de grupamentos O-acetil na molécula, por apresentar uma diferença de m/z 42 em relação ao sinal base. A fração IV (FIGURA 50) apresentou o sinal base em m/z 877, possivelmente correspondendo à um pentassacarídeo. À partir deste sinal foi encontrada uma diferença de 146 unidades de massa, correspondente à uma unidade de rhamnose, que gerou o íon encontrado em m/z 731. Aparentemente, várias substituições por grupamentos O-acetil encontram-se presentes nessa fração, uma vez a diferença de 42 unidades de massa foi observada diversas vezes.

FIGURA 49. Espectro de MALDI-TOF em modo positivo da fração II dos oligossacarídeos de SmR1 isolados em coluna Sephacryl S-100. Matriz utilizada:

DHB

FIGURA 50. Espectro de MALDI-TOF em modo positivo da fração IV dos oligossacarídeos de SmR1 isolados em coluna Sephacryl S-100. Matriz utilizada:

DHB.

Análises mais detalhadas das frações oligossacarídicas não puderam ser realizadas devido à pequena quantidade de material isolado. Entretanto, as diferenças observadas na composição das frações revelam que as estirpes

mutantes RAMEBB e RAMEBC apresentam uma região O-antígeno bastante diferentes da estirpe selvagem de H. seropedicae SmR1. Essa diferença pode ser considerada quando observado o fenótipo de adesão dessas células às raízes de milho. Os mutantes RAMEBB e RAMEBC de H. seropedicae apresentam uma capacidade de adesão 100 vezes menor em relação à estirpe selvagem SmR1³.