Caracterização funcional do VEGF

3.11.1. Ensaio de angiogênese in vitro

Foram utilizadas células endoteliais vasculares umbilicais humanas (HUVECs - Human Umbilical Vein Endothelial Cells) obtidas com a ATCC (American Type Culture Collection), cultivadas em camadas únicas em estufa umidificada contendo 5% CO2 a 37ºC. As células foram cultivadas em meio de cultura RPMI 1640 (Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, EUA) contendo: 10% de soro bovino fetal, 2 mM de L-glutamina (56859 - Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, EUA), 2 mM de piruvato de sódio (P2256 -Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, EUA), 1 mM de aminoácidos não essenciais (M7145 - Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, EUA), 100 U/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina (P4333 -Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, EUA).

O efeito da indução da formação de vasos (angiogênese) pelo VEGF foi avaliado por meio do ensaio de formação de tubos no Matrigel® (GRANT et al., 1989; YEH et al., 2001). Primeiramente, foi realizada uma curva dose-resposta com as concentrações de 20, 40 e 60

ng/mL de VEGF e, como a menor concentração (20 ng/mL) já foi suficiente para indução da angiogênese, esta foi escolhida para este ensaio e para os ensaios funcionais subsequentes. Desta forma, as células (2 x 104 células/poço) foram pré-incubadas por 30 minutos a 37ºC com: meio de cultura (controle negativo), 20 ng/mL de bFGF recombinante (basic fibroblast growth factor ou fator de crescimento de fibroblasto básico - 13256029 – Thermo Fisher Scientific® - Waltham, Massachusetts, EUA), usado como controle positivo, 20 ng/mL de VEGF recombinante e 20 ng/mL das subfrações correspondentes ao VEGF isolado. Após a incubação, as células foram aderidas a uma câmara de cultura revestida com 50 μL de Matrigel 5,25 mg/mL (Corning® Matrigel® Matrix, Tewksbury, MA, EUA), por 18 horas. Após esse tempo, as células foram fotografadas com microscópio invertido (Nikon® Eclipse TS-100, Tóquio, Japão) em objetiva de 20 x e o número de vasos formados foram contados.

3.11.2. Ensaio de migração celular in vitro

3.11.2.1. Obtenção de células mononucleares do sangue total

Foram coletados 10 mL de sangue periférico de 2 indivíduos saudáveis em tubos contendo EDTA (Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético ou Ethylenediamine tetraacetic acid) 5%, de acordo com as normas do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP). O anexo B apresenta o ofício de aprovação do referido projeto no comitê de ética em pesquisa.

Células mononucleares do sangue periférico foram isoladas utilizando-se a metodologia de gradiente de Percoll® (Percoll P-1644, Hanks-Hanks Balanced Salt Solution 1X - H9394 e Hanks-Hanks Balanced Salt Solution 10X- H4385 - Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, EUA). Para isso, partes iguais de 4 soluções com diferentes concentrações de Percoll® (72, 63, 54 e 42%) foram adicionadas a tubos de 15 mL. A seguir, 2 mL do sangue foram colocados na parte superior do tubo contendo as soluções de Percoll formando 5 gradientes de densidades. Essa solução foi ajustada a uma densidade de 1.130 ± 0,005 g/mL a fim de facilitar a recuperação de um grande número de células mononucleares.

Em seguida, essa suspensão (sangue e solução de Percoll®) foi centrifugada (Centrifuge 5702 – Eppendorf®, Hamburgo, Alemanha) a 650 x g por 30 minutos a temperatura ambiente, com aceleração e desaceleração. Assim, as soluções com densidades diferentes permitem a formação de camadas distintas facilitando a recuperação de um grande número de células mononucleares viáveis. Após a centrifugação, as células de interesse foram retiradas com a

ajuda de uma pipeta de Pasteur (K30-300S, Kasvi®, Curitiba, PR, Brasil) e o sangue não utilizado foi descartado devidamente.

As células mononucleares foram colocadas em outro tubo de 15 mL acrescidos de 12 mL de uma solução de lise (Cloreto de amônio 0,8% + EDTA 0,1 mM - 07800, StemCell®, Vancouver, Canadá). Após homogeneização da mistura, esta foi centrifugada a 400 x g por 8 minutos a 12°C. As células foram então ressuspendidas com meio de cultura RPMI (R6504 – Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, EUA) suplementado com BSA 0,1% e centrifugadas novamente nas mesmas condições descritas acima, com aceleração e desaceleração. Após esse procedimento, as células foram ressuspendidas com mais 1 mL do meio de cultura RPMI suplementado com BSA 0,1% e foi realizada a contagem celular em câmara de Neubauer (K5- 0111, Kasvi®, Curitiba, PR, Brasil), em que, uma alíquota de 10 µL da suspensão de células foi misturada com igual volume de líquido de Turk (00066 - Sabre Safety®, Rio das Ostras, RJ, Brasil). O número destas células foi ajustado para 1 x 106_{/mL em meio de cultura RPMI} suplementado com BSA (12657029 - Bovine Serum Albumin, Invitrogen Brasil®, São Paulo, SP, Brasil) a 0,1% para que fossem utilizadas no ensaio de migração in vitro para análise de quimiotaxia.

3.11.2.2. Migração in vitro

No compartimento inferior de uma câmara de quimiotaxia (Kit AP48 - Boyden chamber, Neuro Probe®, Warwick, Reino Unido) foram adicionados 28,6 L (em triplicata) dos seguintes compostos: subfrações contendo VEGF e VEGF recombinante em duas diferentes concentrações (20 e 180 ng/mL). Como controle positivo foi utilizado fMLP, um agente quimiotático (N- Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine - 3506 – Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO, EUA) para células mononucleares a uma concentração de 0,001 μM. Como controle negativo, foi utilizado apenas meio de cultura RPMI suplementado com BSA 0,1%.

Sobre este compartimento inferior foi colocada uma membrana de policarbonato (PCT5013100 – Sterlitech Corporation®, Kent, Washington, EUA) onde as células ficam alojadas em caso de migração no sentido do quimio-atraente e, sobre esta membrana foi posicionada uma membrana de polietileno (provida pelo kit), para que houvesse a vedação do sistema. Por fim, a parte superior da câmara foi montada por meio do encaixe de parafusos contidos no kit da placa. Neste compartimento superior, nos poços, foram adicionados 50 L da suspensão de células mononucleares (1x106 células/mL). Por fim, a câmara ficou incubada

durante 2 horas a 37o C em atmosfera 5% CO2(Forma Series II Water Jacket CO2 Incubator, Thermo Fisher Scientific® - Waltham, Massachusetts, EUA).

Após este período, a membrana de policarbonato foi retirada e corada com o kit de coloração Differential Quick Stain Kit (Diff-Quick - 26096-25 – Electron Microscopy Sciences® - EMS, Hatfield, PA, EUA) e o excesso de corante foi retirado com solução salina 0,9 % (0010175 – Laboratório Sanobiol®, Pouso Alegre, MG, Brasil). A membrana corada, foi fixada em uma lâmina de vidro para a contagem das células que migraram, ou seja, para a avaliação da quimiotaxia induzida pelo VEGF. A contagem das células foi realizada em microscopia óptica.