3.4.1 Padronização e avaliação de bioluminescência in vivo
A partir da confirmação de que os 3 pools celulares apresentavam comportamentos semelhantes in vitro, iniciou-se os protocolos in vivo. Para tal, foram selecionados 15 camundongos C57Bl/6 selvagens machos com idade entre 6-8 semanas, para a administração dos pools celulares. Os animais foram anestesiados intra-peritonealmente com a solução de anestésicos preparadas previamente: 200 ul de solução de ketamina 10% (100 mg/mL) + 100 ul de solução de xilazina 2% (20 mg/mL) + 1,7 mL de PBS 1 X estéril. A partir desta solução, foram aplicados 200 ul em cada animal. Aguardou-se cerca de 10 minutos até os animais estarem completamente anestesiados para a realização da tricotomização e inoculação das células. Os pools celulares foram previamente contados em câmara de neubauer, centrifugados à 5 minutos 200 g e ressuspensos em tubos eppendorf contendo PBS 1 X estéril. Durante a manipulação dos animais os tubos foram mantidos em gelo. Após a tricotomização dos animais, foi realizada 1 aplicação subcutânea de 2.5 x 105
células (100 ul) na região central do flanco de cada animal. 5 animais receberam inoculações com a linhagem Tm1.Luc, outros 5 animais receberam Tm1.Luc.cOVA e os restantes, por sua vez, receberam inoculações de Tm1.Luc.mOVA. Os animais tiveram suas orelhas furadas para auxiliar na identificação e monitoramento de cada um deles. 7 dias após as inoculações, os animais foram levados para a avaliação da emissão de bioluminescência através do uso do equipamento para imageamento in
vitro e in vivo, IVIS Spectrum (PerkinElmer). Primeiramente, antes do início do
padronização do método de detecção e realização de uma cinética de emissão de bioluminescência. Esta etapa é essencial para a padronização do modelo e escolha do melhor tempo para a realização das aquisições das imagens, sendo este dado referente ao pico máximo de emissão de bioluminescências pelas células inoculadas. Trabalhos demonstram que a dinâmica de intensidade do sinal emitido possui uma grande variação entre tumores, de tal forma que alguns tumores levam tempos maiores para que a intensidade máxima de sinal seja atingida. No entanto, este tempo necessário para atingir o sinal máximo é independente do volume tumoral (Shan L et al., 2008). Tendo em vista estas informações, selecionamos um animal C57Bl/6 macho previamente inoculado com a linhagem Tm1.Luc em ambos os flancos para a realização da cinética. Desta forma, o animal selecionado foi submetido à câmara de anestesia inalatória contendo 2% isofurano. Ainda com o animal sedado, foi administrado intra-peritonealmente o substrato previamente preparado: D-Luciferina (Beetle Luciferin, Potassium Salt – Promega, catálogo: E1605) 150 mg/kg solubilizado em PBS 1 X seguida de esterilização em filtro de 0,22 µm. Logo após a administração do substrato, o animal foi rapidamente posicionado na plataforma aquecida, no interior do equipamento, onde ele recebe contínua exposição de isofurano 2%. Para a execução da cinética, o equipamento adquiriu imagens no intervalo de 2 minutos por cerca de 1 hora. As imagens foram então analisadas e estabeleceu-se o tempo de exposição do animal ao substrato D-Luciferina de tal forma a obter o máximo de intensidade de sinal. Os demais animais foram então imageados de acordo com o tempo estabelecido na padronização. A quantificação da bioluminescência utilizando- se o equipamento IVIS Spectrum (PerkinElmer) foi realizada nos grupos de animais no 7º e 14º dia pós-inoculação tumoral.
3.4.2 Avaliação manual do crescimento tumoral
As medições dos tumores manualmente com o auxílio de um paquímetro foram realizadas a partir do 7º dia pós-inoculação quando os tumores já encontravam-se palpáveis. As demais medições ocorreram no 14º e 17º dia pós-inoculação. Ao final das medições, foi realizado o cálculo de volume tumoral (cm³), considerando-se a fórmula: V = 0,5a x b², onde “a” e “b” correspondem ao diâmetro maior e diâmetro menor do tumor, respectivamente.
3.5 Caracterização in vivo das linhagens recombinantes em animais imunodeficientes
3.5.1 Avaliação do crescimento tumoral e emissão de bioluminescência
Após a realização de experimentos in vivo com animais selvagens, procedemos para a avaliação do perfil de crescimento tumoral das linhagens recombinantes quando estas eram inoculadas em animais imunodeficientes a fim de avaliarmos o impacto da participação do sitema imune adaptativo em nosso modelo recém- desenvolvido. Para isso, utilizamos 15 animais machos (6-8 semanas) imunodeficientes C57Bl/6 RAG2-/- , os quais apresentam uma mutação no gene “recombinase 2” com consequente inibição da síntese de receptores de linfócitos T e B (Shinkai U et al., 1992). Desta forma, esses animais carecem destas 2 populações celulares. Dentro destes 15 animais C57Bl/6 RAG2-/-, 5 receberam Tm1.Luc, outros 5 animais receberam Tm1.Luc.cOVA e os restantes receberam Tm1.Luc.mOVA. Juntamente com estes animais, também utilzamos 15 animais C57Bl/6 selvagens pareados com os imunodeficientes. Estes animais também foram inoculados com as 3 linhagens tumorais, respeitando novamente o n = 5 animais/linhagem. Os animais selvagens (grupo controle) e os imunodeficientes (grupo experimental) foram monitorados para avaliação do crescimento tumoral com auxílio do paquímetro nos dias 7º, 10º,14º e 17º e nos dias 7º e 14º eles foram submetidos à análise de bioluminescência in vivo, com o uso do IVIS Spectrum.
3.6 Caracterização in vivo das linhagens recombinantes em animais previamente imunizados com ovalbumina
3.6.1 Preparo da imunização, inoculação e avaliação in vivo
Após a realização dos experimentos para avaliação do perfil de crescimento tumoral das linhagens recombinantes tanto em animais selvagens quanto em imunodeficientes, prosseguimos com uma nova estratégia para verificar se o perfil de crescimento tumoral poderia ser alterado caso os animais fossem previamente imunizados com a proteína ovalbumina e posteriormente desafiados com as linhagens tumorais recombinantes. Sendo assim, selecionamos 15 animais C57Bl/6 selvagens
para constituírem o grupo experimental submetido à imunização e 15 animais C57Bl/6 selvagens (grupo controle) o qual não recebeu a intervenção.
Para a realização da imunização, foi preparada previamente a “emulsão OVA+ CFA” a qual consiste na adição, seguindo a proporção 1:1, de de 2 mg/mL de ovalbumina (OVA) grau V (Sigma-Aldrich, catálogo: A5503) solubilizada em PBS 1 X estéril, com o Adjuvante Completo de Freund (CFA, Sigma-Aldrich, catálogo: F5881). A mistura dos 2 componentes foi realizada com auxílio de seringas de vidro reutilizáveis. Com a emulsão já pronta, cada animal do grupo experimental recebeu a aplicação subcutânea de 2 injeções de 50 ul da emulsão em ambos os lados na base da cauda. Ou seja, cada animal recebeu 100 ug de ovalbumina emulsionada em CFA. Uma vez que o CFA contém na sua composição a bactéria mycobacterium
tuberculosis na forma inativada, é considerado um potente adjuvante dado a sua
contribuição na ativação da resposta imune. 7 dias após a imunização, todos os animais (grupo controle e experimental) receberam as linhagens tumorais Tm1.Luc, Tm1.Luc.cOVA e Tm1.Luc.mOVA, respeitando o n = 5 animais/linhagem. Os 2 grupos foram então monitorados para avaliação do crescimento tumoral manual e emissão de bioluminescência in vivo, conforme os mesmos critérios adotados nos experimentos anteriores já descritos.