Caracterização da infestação por triatomíneos e infecção natural pelo T cruzi

Foram definidos os indicadores de infestação (porcentagem de unidades domiciliares (UD’s) positivas para triatomíneos em relação às pesquisadas), infecção

natural (porcentagem de triatomíneos infectados pelo T.cruzi em relação aos examinados)

e colonização (porcentagem de casas positivas com ninfas no intradomicílio em relação ao número de casas positivas no intradomicílio), buscando identificar qual a espécie de triatomíneo predominante, bem como seu estádio evolutivo e local de captura (intradomicílio e/ou peridomicílio). A unidade domiciliar (UD) é a união do ambiente intradomiciliar e o peridomiciliar, ou seja, é a habitação humana e o seu entorno, com todas as edificações permanentes, temporárias, acúmulos de matérias, cercas, abrigos de animais etc.

Todas as unidades domiciliares das localidades selecionadas foram pesquisadas pelos agentes de endemias de forma manual, conforme preconiza o Manual de Normas Técnicas da Campanha de Controle da Doença de Chagas do Ministério da Saúde (1980), utilizando como instrumento de coleta de dados os formulários próprios dessa atividade

(Anexo G). Foram inspecionados todos os locais possíveis de abrigar triatomíneos, seja na casa, nos anexos e em todos os outros locais da unidade domiciliar que estiverem sendo pesquisados (cercas, materiais expostos, alpendres etc). Todas as superfícies, internas e externas, de paredes, móveis, outros utensílios e objetos diversos devem ser observados (BRASIL, 1980). Além das informações rotineiras obtidas no formulário padrão de campo (Anexo G), foi anotado o local específico de captura, conforme Anexo H. O intradomicílio foi considerado como um único lugar, e o peridomicílio dividido em tipos de anexos: 1) galinheiro; 2) chiqueiro; 3) paiol; 4) lenha; 5) pedra, telha e tijolo; e 6) outros.

Os triatomíneos encontrados foram levados ao Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da Doença de Chagas (LATEC) do CPqRR/FIOCRUZ-MS para identificação quanto à espécie, estádio de desenvolvimento, infecção natural pelo T. cruzi, e identificação de fontes alimentares. Os dados foram organizados conforme modelo em anexo (Anexo I).

A pesquisa triatomínica no ambiente silvestre foi realizada de forma manual, ao anoitecer, com auxílio de lanterna, nos mesmos locais da captura dos mamíferos. O período de captura foi o referente à primeira campanha (fevereiro/2009), por quatro noites consecutivas. Os insetos foram separados por local, para posterior identificação quanto à espécie, estádio de desenvolvimento, infecção pelo T. cruzi e identificação de fontes alimentares. Diante dos baixos resultados para a identificação de fontes alimentares encontrados nesse período, uma pesquisa complementar foi realizada em agosto/2009 nos mesmos locais e seguindo a mesma metodologia.

4.6. Identificação da fonte alimentar

A identificação da fonte alimentar foi realizada para complementar a lista de animais que compartilham o ambiente silvestre com o T. brasiliensis e determinar aqueles que realmente participam desse processo.

Para a extração do DNA dos triatomíneos as asas e o conexivo (adultos) foram retirados, bem como a cutícula superior do abdomen. Com uma tesoura de dissecção, foi separada a porção lateral da parte central do abdomen, sendo a parte central, local que se encontra o tubo digestivo, destinado à extração do DNA. Nos insetos em que é possível observar grande quantidade de sangue no tubo digestivo, a extração é realizada da porção terminal do abdomen (aproximadamente a partir do sexto tergito). Em ninfas de terceiro estádio, ao invés de retirar a cutícula abdominal superior, é feito um corte em

forma de “V” no abdômen, de maneira que a porção terminal seja destinada à extração. Em ninfas menores, devido ao seu tamanho reduzido, é extraído o DNA da porção abdominal inteira.

As extrações foram processadas em tubos eppendorfs e seguiu protocolo de HotShot (TRUETT et al., 2000). O conteúdo alimentar do inseto (sangue + tecido) foi macerado com o auxílio de um pistilo em 50 ml de solução de lise (25 mM NaOH, 0,2 mM de EDTA). Seguiu-se a incubação deste material a 95°C durante 30 minutos. Após a incubação, as amostras foram colocadas em gelo durante cinco minutos e em seguida, foram adicionados 50 ml de solução de neutralização (40 mM Tris-HCl). As amostras, então, foram centrifugadas rapidamente (20 segundos a 14000 rpm) e o sobrenadante armazenado em tubos tipo eppendorf até a amplificação por PCR.

A qualidade e concentração do DNA purificado foram mensuradas em espectrofotômetro Nanodrop ND 1000, sendo o grau de pureza das amostras determinado pela reação de absorbância 260/280nm de comprimento de onda.

4.6.1. Amplificação do DNA (PCR)

A identificação das fontes alimentares dos triatomíneos foram realizadas utilizando um par de iniciadores que amplificam parte do mtDNA do gene citocromo B (CytB). Estes iniciadores, L14841 5’- AAAAAGCTTCCATCCAACATCTCAGCATGA TGAAA-3’ e H15149 5’- AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3’, designados iniciadores universais para animais vertebrados (KOCHER et al., 1989), amplificam um fragmento de 305pb e possuem a vantagem de não amplificar o DNA dos triatomíneos presentes no tecido animal.

A reação de PCR foi realizada em um volume final de 25µl, contendo 2,5µl de Buffer 10X (Promega); 2,0µl de dNTP 2,5mM; 0,75µl de MgCl2 50mM; 2,5µl de cada iniciador 10pmol; 0,2µl de Taq Polimerase 0,5U/µl (Invitrogen) e 2,5µl de DNA. Para cada reação de PCR um controle negativo (sem DNA) foi corrido em paralelo.

A amplificação é realizada em termociclador (Eppendorf Mastercycler), sendo que as condições estabelecidas para as reações de sequências foram: desnaturação inicial por 95ºC por 5 min, 95°C por 30 segundos, temperatura de anelamento dos iniciadores de 58°C por 30 segundos, temperatura de extensão a 72°C por 1 minuto, retorna ao passo 2 e repete 35 vezes, extensão final de 72°C por 6 minutos.

Após a PCR, 3µl do produto amplificado é submetido a eletroforese em gel de poliacrilamida a 8% para ver se a PCR amplificou a banda de interesse.

4.6.2. Purificação do DNA

A purificação do produto da PCR (banda de interesse) foi realizada utilizando o QIAquick PCR Purification Kit – Qiagen, segundo protocolo do fabricante. Após a purificação, a qualidade e concentração do DNA purificado foram mensuradas em espectrofotômetro Nanodrop ND 1000, sendo o grau de pureza das amostras determinado pela reação de absorbância 260/280nm de comprimento de onda.

4.6.3. Reação de Sequenciamento e Precipitação de DNA

Para cada amostra a ser sequenciada em sequenciador ABI 3730, utilizou-se 10 ng do DNA amplificado. Para a preparação do mix utiliza-se 1 µl de cada iniciador (5 pmol/µL), 1µl de Big Dye, 1µl de tampão e 1µl do produto de PCR amplificado e q.s.p 10µl de H2O. Utiliza-se um termociclador (Eppendorf Mastercycler) com um programa de 35 ciclos, nas seguintes temperaturas: desnaturação inicial por 96°C por 1 minuto, anelamento por 96°C por 15 segundos, temperatura de extensão 58°C por 15 segundos, retorna ao passo 2 e repete 35 vezes, extensão final de 60°C por 4 minutos.

A precipitação do DNA para a reação de sequenciamento foi realizada segundo protocolo abaixo:

- Adicionar 1µL de EDTA em cada poço;

- Adicionar 1µL de acetato de amônio 7,5M ou acetato de sódio 3M; - Adicionar 50µL de etanol 100%;

- Selar a placa com adesivo e vortexá-la brevemente; - Incubar a placa por 15 min dentro da centrífuga desligada; - Centrifugar por 45 min a 3700 RPM, temperatura ambiente; - Verter a placa, descartando o sobrenadante;

- Adicional 100 µL de etanol 70%; - Centrifugar por 15 min a de etanol 70%;

- Centrifugar por 15 min a 3700 RPM, temperatura ambiente; - Verter e dar um spin na placa invertida;

4.6.4. Identificação das sequências

A identificação da fonte alimentar foi obtida por comparação entre a sequência de DNA obtida à depositadas na plataforma geneBank utilizando a ferramenta Blast.