Caracterização molecular

Para o sequênciamento o produto da PCR foi purificado utilizando o kit comercial (GFX PCR & DNA Gel Band Purification kit; (GE Healthcare, Giles, United Kingdom). O sequênciamento do amplicon foi realizado no sequênciador MegaBACE1000 da GE Healthcare Life Sciences, empregando um kit comercial (DYEnamic ET terminator sequencing kit; (GE Healthcare, Giles, United Kingdom) conforme descrito pelo fabricante. O fragmento sequênciado foi submetido à análise filogenética utilizando o programa Bioedit 7.0.1 para edição e o programa MEGA 4.1. O método utilizado para a análise filogenética foi o de

“neighbor-joining” seguindo os parâmetros Kimura-2, utilizando sequências do BoHV-1 e BoHV-5 armazenadas no GenBank e como grupo externo foi utilizando PrV (herpesvírus suíno tipo 1 - SuHV-1).

3 RESULTADOS

À necrópsia observaram-se hiperemia das leptomeninges, achatamento dos giros telencefálicos e lobos frontais de coloração castanho-amarelada e consistência friável. Microscopicamente, constataram-se áreas extensas de hemorragia e manguito perivascular composto por células mononucleares no córtex, assim como meningite mononuclear, caracterizando meningoencefalite não supurativa. Em algumas dessas áreas identificaram-se astrocitose focal, corpúsculo de inclusão (CI) basofílico intranuclear e áreas de congestão. Na região parietal telencefálica observaram-se manguito perivascular e mononuclear (FIGURA 1A), tumefação endotelial, hemorragia parenquimatosa, CI intranuclear em astrócitos e malácia caracterizada pela lise do parênquima neural e acentuada quantidade de células Gitter (FIGURA 1B).

FIGURA 1- Região parietal telencefálica. Lesões microscópicas observadas no sistema nervoso central. A) Área extensa de hemorragia associada e manguito perivascular de células mononucleares (asterisco); HE – 10X. B) Área de malacia caracterizada pela presença células Gitter (setas pretas) e hemorragia; HE – 40X

No colículo foram observadas astrocitose e congestão difusa, de intensidade moderada. No óbex visualizou-se infiltrado mononuclear perivascular moderado multifocal. Nos núcleos da base estavam presentes áreas com corpos de neurônios com CI intranucleares, além de infiltrado mononuclear perivascular mononuclear discreto multifocal e tumefação endotelial.

Após 48 horas de inoculação em cultivo celular foi observado efeito citopático (ECP) (FIGURA 2). Com o uso de anticorpos policlonais por IFD, foi confirmada a presença de BoHV na amostra que foi denominada GO 01/09. A reação de nPCR seguida de REA demonstrou que a amostra GO 01/09 tratava-se de BoHV-5.

FIGURA 2 - Amostra Go01/09 inoculada em cultivo celular – células MDBK. A) cultivo celular após 48 horas de inoculação e B) cultivo celular pós 72 horas de inoculação.

A análise filogenética revelou que a amostra GO01/09 está agrupada com amostras da América do Sul do BoHV-5a e BoHV-5b, em um grupo distinto das amostras “non-a, non-b” (ISO87 e ISO45) detectadas no Sudeste em 1990 (FIGURA 3). Pela REA confirmou-se que a amostra GO01/09 pertence ao subgrupo BoHV-5a (FIGURA 4), conforme classificação sugerida por D'ARCE et al. (2002).

FIGURA 3 - Árvore filogenética construída a partir de sequências da glicoproteína C, de diferentes amostras de herpesvírus bovino depositadas no GenBank e da amostra ()GO01/09.

FIGURA 4 - Análise com enzima de restrição BstEII. Linhas 1 e 4. Padrão de peso molecular lambda digerido com HindIII; linha 2. amostra GO01/09 e linha 3 amostra EVI 88/95.

4 DISCUSSÃO

A meningoencefalite por BoHV-5 é uma enfermidade frequentemente fatal, diagnosticada em diversos Estados brasileiros. O caso descrito ocorreu em uma propriedade em Goiás, na região Centro-Oeste, onde quatro animais de um lote de 100 manifestaram sinais neurológicos com evolução ao óbito. Entretanto, apenas um foi submetido a avaliação e confirmação de meningoencefalite herpética. O lote, ao qual pertencia o animal deste relato, era constituído por animais um ano e meio a dois anos de idade, faixa etária em que é identificada a maior incidência de casos de BoHV-5 (ELIAS et al., 2004). O período de evolução da doença até a morte ocorreu em 24 horas, assim como referido anteriormente (RIET-CORREA et al., 2006). Os sinais clínicos observados no bezerro foram os mesmos descritos por ELIAS et al. (2004).

Algumas alterações macroscópicas foram similares às descritas anteriormente (RIET-CORREA et al., 2006), porém não foram visualizadas cavitações encefálica, provavelmente devido ao curto período de evolução da doença. As lesões microscópicas, observadas e descritas no presente relato, caracterizadas por manguito perivascular mononuclear, áreas de malácia com acentuada quantidade de células Gitter e hemorragia, são comumente descritas (SALVADOR et al., 1998, COLODEL et al., 2002; ELIAS et al., 2004). Os CI intranucleares basofílicos foram facilmente encontrados nos astrócitos e em alguns neurônios da região de núcleos da base e este achado é característico nas infecções por herpesvírus (ELIAS et al., 2004).

O ECP observado após 48 horas de inoculação foi característico de BoHV, conforme o descrito WEIBLEN et al. (1992), apresentado células arredondadas e agrupadas em focos, com aspecto de "cachos de uva", sendo confirmado pela identificação de antígenos para BoHV pela imunofluorescência. A caracterização viral e diferenciação em BoHV-1 ou BoHV-5 foi realizada pela nested PCR, determinando a amostra GO 01/09 como BoHV-5, conforme descrito por ESTEVES et al. (2008) e CAMPOS et al. (2009).

No intuito de identificar a qual subtipo de BoHV-5 o GO 01/09 pertence, foi empregada a REA, utilizando a enzima BstEII, que permite subtipificar o

BoHV-5 (D’ARCE et al., 2002), sendo então caracterizado como BoHV-BoHV-5a. Ainda não há estudos sobre diferenças na patogenia ou virulência sobre os subtipos de BoHV-5.

Apesar de evidências clínicas e soroepidemiológicas, amostras de herpesvírus em bovinos com encefalopatias ainda não haviam sido isoladas e caracterizadas, sendo este o primeiro relato de isolamento e caracterização de BoHV-5 em caso clínico de bovino de Goiás com enfermidade neurológica. Estes achados vem complementar o histórico sobre o BoHV-5 no Brasil que ainda conta com poucos dados sobre sua ocorrência na região Centro-Oeste.

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