Caracterização Morfo-histológica e Bioquímica

CAPÍTULO IV – EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA EM PUPUNHA: I Utilização de embriões zigóticos como fonte de explantes

5.3 Caracterização Morfo-histológica e Bioquímica

Embriões zigóticos de pupunha (Figura 3A) foram inoculados em meio de cultura contendo 10 µM de picloram como fonte de auxina. Esses embriões zigóticos apresentavam-se oblongos com comprimento entre 1,5 mm a 2 mm, formato cônico, epicótilo oblíquo a lâmina cotiledonar e presença de procambio conectando o cotilédone ao meristema (Figura 3A). Foi possível observar um intumescimento na região do mesocótilo do embrião zigótico (Figura 3B) rompendo a protoderme (Figura 3C) ocorrendo, posteriormente, em todas as regiões do embrião zigótico (Figura 3D) formando o calo primário.

As análises histológicas revelaram o início da divisão celular nos tecidos sub-epidérmicos

b b b b a 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 1 5 10 50 AgNO ( M) E m b ri õ es som á ti co s (u n) µ 3 A B

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(Figura 4B), principalmente naquelas células adjacentes aos feixes vasculares na região do mesocótilo do embrião zigótico (Figura 4C), resultando em uma camada de 3 a 5 células com características meristemáticas, como células pequenas, parede celular delgada e núcleo com reação a coloração de azul de toluidina. Após 30 dias de cultivo, a proliferação celular progrediu por toda a lâmina cotiledonar (Figura 4D) e estas células apresentavam poucos grãos de amido (Figura 4E). Neste período de cultivo, o meristema apical do embrião zigótico não apresentava nenhuma alteração morfológica aparente (Figura 4D). Já após 60 dias de cultivo, o calo primário foi formado em toda a região da lâmina cotiledonar e com início da calogênese na região do meristema (Figura 4F).

O crescimento dos calos primários foi de forma anelar, assegurado por uma camada específica de células, que formaram uma zona meristemática (Figura 4G). Essa zona meristemática era composta por camada de três a seis células com características meristemáticas e plano de divisão principalmente periclinal (Figura 4H). Já a periferia do calo primário era composta por células maiores e parede celular delgada (Figura 4G; 4H), enquanto a região central do calo era composta por células parenquimáticas, com todos os planos de divisão celular; alguns elementos de vaso diferenciados puderam ser observados (Figura 4I).

Estruturas globulares foram observadas e estas eram formadas primeiramente naqueles calos com origem da região do mesocótilo do embrião zigótico (Figura 3F). Após cinco meses de cultivo a formação dessas estruturas globulares evoluía formando um calo embriogênico compacto (Figura 3G). Nessas condições, também foi possível observar a presença de embriões somáticos naqueles calos com origem da região do meristema (Figura 3H), contudo em menor intensidade em relação àqueles calos originados do mesocótilo (Figura 3I).

A partir da análise histológica das estruturas globulares, foi observada a presença de uma protoderme delimitada, evidenciando que estas estruturas são embriões somáticos no estágio de desenvolvimento globular (Figura 3J). A origem dos embriões somáticos foi a partir das células da zona meristemática (Figura 3L), sugerindo o padrão de origem multicelular. Embriões somáticos que não apresentavam nenhuma conexão vascular com o tecido matriz foram observados (Figura 3M).

Para a análise bioquímica, não foram detectadas diferenças significativas no perfil protéico dos calos primários com característica embriogênica e dos que não apresentavam capacidade embriogênica (Figura 5). Por outro lado, nos calos embriogênicos nodulares obtidos (Figura 3I) foi observada a presença de duas bandas protéicas de alto peso molecular (Figura 5).

FIGURA 3. Embriogênese somática a partir de embriões zigóticos de pupunha (B. gasipaes). A – Aspecto do embrião zigótico. B – Intumescimento na região do mesocótilo (seta) do embrião zigótico duas semanas após inoculação. C – Inicio do desenvolvimento do calo primário na região do mesocótilo do embrião zigótico (seta larga) e intumescimento da região do meristema apical (seta estreita). D – Crescimento do calo primário (seta larga) e inicio de formação de calo na região do meristema apical (seta estreita) após 60 dias de cultura. E – Calo primário obtido a partir de embriões zigóticos de pupunha, após 90 dias de cultura com origem na região do mesocótilo (seta larga) e do meristema apical (seta estreita). F – Desenvolvimento de estruturas globulares (seta) na superfície do calo primário. G – Calo apresentando o desenvolvimento de estruturas embriogênicas. H - Detalhe de embrião somático (seta) observado no calo primário obtido a partir da região do meristema apical. I – Detalhe do calo embriogênico observado em calo primário obtido a partir da região do mesocótilo. J – Plântulas obtidas a partir da conversão de embriões somáticos em meio de cultura de maturação. L – Desenvolvimento de raízes (seta) em calos embriogênicos de pupunha mantidos em meio de cultura de maturação. M – Calo embriogênico com aspecto friável e desenvolvimento de várias estruturas globulares. N – Perda da capacidade embriogênica dos calos embriogênicos friáveis após subcultivo. O – Maturação e desenvolvimento dos embriões somáticos. P – Embrião somático maturo isolado. Q – Embrião somático durante o processo de conversão. R – Plântulas obtidas a partir de embriões somáticos. S – Plântulas cultivadas em meio de cultura isento de fitorreguladores. T – Plântulas preparadas para a aclimatização. U – Sistema de aclimatização utilizado no presente estudo. V – Plântulas aclimatizadas mantidas em casa de vegetação. Figuras A-C, H-I, M-Q barra=1mm; Figuras D-G, J, L, P barra=2mm; Figuras S e T barra=2,5cm; Figura V barra=5cm.

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FIGURA 4. Análises histológicas da embriogênese somática a partir de embriões zigóticos de pupunha (B. gasipaes). A – Secção longitudinal do embrião zigótico. B – Embrião zigótico após duas semanas de cultivo, notar proliferação celular nos tecidos subepidermicos. C – Detalhe do inicio da proliferação celular (setas) a partir de embriões zigóticos. Notar a presença de elementos de vaso. D – Embrião zigótico após trinta dias de cultivo evidenciando a proliferação celular ao longo de toda a lâmina cotiledonar. E – Detalhe das células em divisão apresentando a presença de grãos de amido. F – Aspecto da formação de calo primário em toda região da lâmina cotiledonar e do meristema apical. G – Calo primário evidenciando a presença de uma zona meristemática. H – Detalhe das células da zona meristemática. I – Detalhe das células no interior dos calos primários de pupunha. Notar a presença de elementos de vasos. J – Embriões somáticos globulares com protoderme delimitada. L – Embriões somáticos alongados. Notar a presença da zona meristemática. M – Secção transversal de um calo embriogênico evidenciando a presença de vários embriões somáticos sem conexão vascular com o tecido matriz. Figuras A, B, D, F, L, M barra=500µm; Figuras C, E, G-J barra=200µm. pc – procambio; ma – meristema apical; pd – protoderme; am – amido; zm – zona meristemática; ev – elementos de vaso; es – embriões somáticos.

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FIGURA 5. Análise do perfil protéico em gel de poliacrilamida-SDS de calos primários de pupunha (B. gasipaes) sem competência embriogênica (NE), com competência embriogênica (E) e dos calos embriogênicos propriamente ditos (CE) induzidos em meio de cultura MS suplementado com 10µM de picloram. Padrão de peso molecular (Sigma-Marker® 4038).

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No documento Germinação in vitro, criopreservação e embriogênese somática em pupunha (páginas 85-93)