Caracterização química

Efetuou-se a caracterização química à bebida de amêndoa, aos coprodutos resíduo e soro de amêndoa assim como ao resíduo hidrolisado enzimaticamente.

2.1.3.1. Hidrólise do resíduo de amêndoa

Com o objetivo de aumentar o potencial prebiótico do resíduo de amêndoa procedeu-se à hidrólise enzimática do mesmo com recurso ao complexo multi-enzima Viscozyme® _L (Sigma-Aldrich, USA). Resumidamente, colocaram-se 40 g de resíduo de amêndoa em 2 L de água destilada (1 g/50 mL) e com uma vareta de vidro homogeneizou-se a mistura e ajustou- se o valor de pH para 4,5. De seguida, adicionaram-se 100 mg de Viscozyme® _{L por g de} amostra de resíduo de amêndoa e colocou-se a mistura em banho de água termostatizado (12B, Julabo, Alemanha) a 50 ºC durante 24 h. Após este período, a mistura foi filtrada com filtro de papel, foi congelada a -80 ºC e por fim liofilizada ao longo de 5 dias no liofilizador (Loc 1-m, Christ, Alemanha).

2.1.3.2. Acidez titulável

Para a determinação da acidez titulável da bebida, resíduo e soro de amêndoa transferiram-se, em duplicado, 5 g de cada amostra para matrazes de 100 mL, e acrescentou-se 50 mL de água morna (40 ºC) isenta de gás carbónico. Com a ajuda de uma vareta de vidro agitou-se a mistura até dissolução possível. Transferiu-se em seguida, a mistura para um balão volumétrico de 100 mL e perfez-se o volume com água. Em seguida, transferiu-se 50 mL da mistura para um gobelé e adicionaram-se 10 gotas de solução alcoólica de fenolftaleína a 1 % (m/v), e titulou-se com uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) a 0,1 N até se obter uma

27 leve coloração rosácea persistente por aproximadamente 30 s. A diferença entre os volumes inicial e final foi registada e a percentagem de ácido láctico foi calculada a partir da seguinte equação (Equação 2.2):

Ácido láctico (%) = 𝑉×𝑓×0,9

𝑚 2.2 sendo f o fator de correção da solução de NaOH, 0,9 o fator de conversão do ácido láctico e m a massa da amostra em gramas.

2.1.3.3. Quantificação de açúcares totais

A determinação de açúcares totais foi efetuada pelo método fenol-ácido sulfúrico (Dubois et

al., 1956) recorrendo à curva de calibração (Apêndice 7.1) previamente estabelecida usando

diferentes volumes de uma solução padrão de glucose (correspondente a concentrações entre 0,05-0,30 mg/mL), e os resultados foram expressos como concentração de açúcares totais (mg de açúcares totais/g). Foram pesados entre 10 a 20 mg de amostra para 1 mL de dH2O em eppendorfs de 1,5 mL. A mistura foi homogeneizada no vortex e subsequentemente foram feitas as diluições necessárias para que os valores se encontrassem dentro da curva de calibração. De seguida, pipetaram-se 80 µL de amostra, 150 µL de solução aquosa de fenol (5% (m/v)) e 1 mL de ácido sulfúrico concentrado para tubos de ensaio. Os tubos foram colocados 10 min em banho de água termostatizado (12B, Julabo, Alemanha) a 100ºC, procedendo-se depois à leitura das absorvâncias a 490 nm utilizando o espetrofotómetro UV- Vis (UVmini 1240, Shimadzu, EUA). Todas as medições foram efetuadas em triplicado.

2.1.3.4. Quantificação de proteínas totais

A quantificação de proteínas totais nas diferentes amostras foi efetuada utilizando o kit PierceTM _{BCA Protein Assay (Thermo Scientific, EUA) em microplaca de 96 poços (96 Well-} F, Sarstedt, Alemanha), recorrendo à curva de calibração (Apêndice 7.2) estabelecida usando diferentes concentrações de solução padrão de albumina (correspondente a concentrações entre 0,0 e 4,0 mg/mL), e os resultados foram expressos como concentração de proteína total (mg de proteína total/g). Foram pesados aproximadamente 10 mg de cada amostra para

eppendorfs de 1,5 mL e foi adicionado 1 mL de dH2O. Depois de se homogeneizar a mistura num vortex, efetuaram-se as diluições necessárias para que os valores se encontrassem dentro da curva de calibração. A mistura de reagentes foi preparada numa proporção de 50 partes de Reagente A para 1 parte de Reagente B do kit. De seguida, adicionaram-se 200 µL da mistura dos reagentes a 25 µL de amostra e colocou-se numa estufa a 37 ºC durante 30 min. Ao fim deste tempo, procedeu-se à leitura das absorvâncias a 562 nm utilizando um leitor de

28 microplacas com fluorescência (Multiskan GO v1.00.40, Thermo Scientific, EUA) e usando o programa SkanIt Software, versão 4.1.0.43. Todas as medições foram efetuadas em triplicado e foi efetuado um branco com água.

2.1.3.5. Quantificação de ácidos gordos esterificados e não esterificados

Os ácidos gordos esterificados e não esterificados foram quantificados diretamente pelo protocolo FAME de acordo com Pimentel et al. (2015). Para a realização deste procedimento foram pesados 500 mg de cada amostra em tubos de ensaio. Para a primeira reação (Reação da fase K, ácidos gordos esterificados) pipetaram-se 200 µL de TG C13, 100 µL de FFA C11, 100 µL de metil acetato, 3,7 mL de hexano e 2,26 mL de metanol. De seguida, adicionaram- se 240 µL de metóxido de sódio e homogeneizou-se a mistura num vortex por 10s. Depois os tubos foram colocados a 40ºC durante 10 min. Depois de arrefecerem, adicionaram-se aos tubos de ensaio 500 µL de H2O para se interromper a reação e homogeneizou-se novamente a mistura por 10s. Subsequentemente, os tubos foram centrifugados a 1250 rpm durante 5 min. Por último, retirou-se o sobrenadante e transferiu-se para tubos de falcon contendo 200 µL de FAME C23, constituindo a fase K. Desses tubos retirou-se 1 mL para vials para posterior análise por cromatografia gasosa (GC System 6890, HP, EUA). Para a segunda reação (Reação da fase H, ácidos gordos não esterificados), o conteúdo dos tubos de ensaio foi ressuspendido em 2 mL de hexano e homogeneizou-se a mistura durante 15s. Depois, os tubos foram centrifugados a 1250 g durante 5 min. Retirou-se o sobrenadante para os tubos de falcon e adicionaram-se 100 µL de FAME C23, 1,25 mL de dimetilformanido (DFM), 1,25 mL de ácido sulfúrico (3 M) e colocaram-se os tubos a 60 ºC durante 30 minutos. Depois de arrefecidos adicionaram-se 750 µL de hexano e homogeneizou-se a mistura durante 1 min. Por fim, os tubos foram centrifugados a 1250 rpm durante 10 min e retirou-se o sobrenadante para vials para serem analisadas por cromatografia gasosa.

As condições de análise foram as seguintes: injetor (split 25:1, volume de injeção de 1 µL); temperaturas do injetor e do detetor de 250 e 275 ºC, respetivamente; taxa de fluxo de 1 mL/min. A temperatura inicial do forno é de 60 ºC, aumentando depois para a temperatura final de 225 ºC. Todas as análises foram efetuadas em duplicado. Os resultados foram determinados através da integração dos cromatogramas e expressos como concentração de ácidos gordos (AG) (µg de AG/mg). Os limites de deteção (LD) e de quantificação (LQ) são, respetivamente, 0,79 ng AG/mL e 2,64 ng AG/mL.

29