Os resultados da variação de massa corpórea dos camundongos mostraram que, em comparação com o grupo controle com zinco, o grupo controle sem zinco apresentou aumento significativo de massa corpórea a partir do 11° dia da segunda fase do experimento até o último dia (controle com zinco: -2,07 ± 0,81% versus controle sem zinco: 2,69 ± 0,71%) (Figura 15A). Também, quando comparamos a variação da massa corpórea do grupo obeso com zinco com o grupo obeso sem zinco, observamos que o grupo obeso sem zinco apresentou aumento significativo a partir do 25° dia da segunda fase do experimento até o último dia (obeso com zinco: - 1,13 ± 1,13% versus obeso sem zinco: 5,04 ± 1,66%) (Figura 15C).
Figura 15. Avaliação do volume de massa corpórea dos
camundongos do grupo controle com zinco (n = 9) e do grupo controle sem zinco (n = 9), e do grupo obeso com zinco (n = 9) e do grupo obeso sem zinco (n = 9). (A) Variação de massa corpórea do grupo controle com zinco e do grupo controle sem zinco. Two- way ANOVA; (B) Fotografia representativa dos camundongos do grupo controle com zinco (cauda em verde) e do grupo controle sem zinco (cauda em vermelho); (C) Variação de massa corpórea do grupo obeso com zinco e do grupo obeso sem zinco. Two-way ANOVA; (D) Fotografia representativa dos camundongos do grupo obeso com zinco (cauda em verde) e do grupo obeso sem zinco (cauda em vermelho). *p< 0,05; ** p< 0,01; *** p< 0,001 e p< 0,0001.
Os resultados da avaliação do índice de Lee mostraram que entre o grupo controle com zinco e o grupo controle sem zinco não houve diferença significativa (Figura 16A); o mesmo foi observado quando comparamos o índice de Lee entre o grupo obeso com zinco e o grupo obeso sem zinco (Figura 16C).
Figura 16. Avaliação do índice de Lee dos camundongos
do grupo controle com zinco (n = 9) e do grupo controle sem zinco (n = 9), e do grupo obeso com zinco (n = 9) e do grupo obeso sem zinco (n = 9). (A) Índice de Lee por semana do grupo controle com zinco e do grupo controle sem zinco. Two-way ANOVA; (B) Índice de Lee do último dia de experimento do grupo controle com zinco e do grupo controle sem zinco. Test t; (C) Índice de Lee por semana do grupo obeso com zinco e do grupo obeso sem zinco. Two-way ANOVA; (D) Índice de Lee do último dia de experimento do grupo obeso com zinco e do grupo obeso sem zinco. Test t.
Os resultados da avaliação do consumo de ração entre o grupo controle com zinco e o grupo controle sem zinco (Figura 17A e 17B), e entre o grupo obeso com zinco e o grupo obeso sem zinco, não mostraram diferença significativa (Figura 17C e 17D).
Figura 17. Avaliação do consumo de ração dos
camundongos do grupo controle com zinco (n = 9) e do grupo controle sem zinco (n = 9), e do grupo obeso com zinco (n = 9) e do grupo obeso sem zinco (n = 9). (A) Consumo de ração do grupo controle com zinco e do grupo controle sem zinco; (B) Consumo individual de ração do grupo controle com zinco e do grupo controle sem zinco; (C) consumo de ração do grupo obeso com zinco e do grupo obeso sem zinco; (D) Consumo individual de ração do grupo obeso com zinco e do grupo obeso sem. Test t.
Os resultados dos parâmetros hematológicos, quando comparamos o grupo controle com zinco e o grupo controle
sem zinco, e quando comparamos o grupo obeso com zinco e o grupo obeso sem zinco, observamos que não houve alteração nos parâmetros analisados compreendendo a contagem de leucócitos, plaquetas e hemácias, bem como concentração de hemoglobina e hematócrito dos animais (Figura 18).
Figura 18. Parâmetros hematológicos dos camundongos do
grupo controle com zinco e do grupo controle sem zinco, e do grupo obeso com zinco e do grupo obeso sem zinco. (A) leucócitos; (B) plaquetas; (C) hemácias; (D) hemoglobina; (E) hematócrito. One-way ANOVA.
Os resultados dos parâmetros bioquímicos, nesta fase demonstraram uma diferença significativa da concentração do Aspartato aminotransferase (AST) quando comparamos do grupo controle com o grupo controle sem zinco (grupo controle: 76,33 ± 5,850 mg/dl versus grupo controle sem zinco: 349,5 ± 175,5 mg/dl) (Figura: grupo controle 19F), e quando comparamos o grupo controle com o grupo obeso sem zinco (grupo controle: 76,33 ± 5,850 mg/dl versus grupo obeso sem zinco: 254,0 ± 146,0 mg/dl) (Figura: grupo obeso 19F).
Figura 19. Parâmetros bioquímicos dos camundongos do
grupo controle com zinco (n = 2) e do grupo controle sem zinco (n = 2), e do grupo obeso com zinco (n = 2) e do grupo obeso sem zinco (n = 2). (A) colesterol; (B) triglicerídeos; (C) glicose; (D) Ureia; (E) AST; (F) ALT. One-way ANOVA. * p < 0,05.
Com relação às adipocinas avaliadas (adiponectina e leptina), quando comparamos o grupo controle com zinco e o grupo controle sem zinco, os resultados mostraram apresentar alterações significativas da concentração da adiponectina, onde o grupo controle sem zinco está reduzido (controle com zinco: 8,081 ± 0,2193 ng/mL versus controle sem zinco: 5,488 ± 0,9001 ng/mL) (Figura: grupo controle 20A) e da concentração da leptina, onde o grupo controle sem zinco está aumentado (controle com zinco: 26,98 ± 2,253 ng/mL versus controle sem zinco: 32,81 ± 1,021 ng/mL) (Figura: grupo controle 20B). Já a concentração de insulina não apresentou diferença significativa entre o grupo controle com zinco e o grupo controle sem o zinco (Figura: grupo controle 20C). E quando avaliamos os resultados da concentração da adiponectina, da leptina e da insulina, observou-se que não houve diferença significativa quando comparamos o grupo obeso com zinco e o grupo obeso sem zinco (Figura: grupo obeso 20A, 20B e 20C, respectivamente).
Figura 20. Concentração da adiponectina, leptina e insulina
dos camundongos do grupo controle com zinco (n = 2) e do grupo controle sem zinco (n = 2), e do grupo obeso com zinco (n = 2) e do grupo obeso sem zinco (n = 2). (A) Concentração de adiponectina; (B) Concentração de leptina; (C) Concentração de insulina. Test t. * p < 0,05.
Grupo obeso
O volume da massa do tecido adiposo e o fígado foram avaliados. Nos resultados obtidos observou-se que, quando comparamos o grupo controle com zinco com o grupo controle sem zinco (Figura 21A – tecido adiposo – e 21B – fígado), e quando comparamos o grupo obeso com zinco com o grupo obeso sem zinco (Figura 21C – tecido adiposo – e 21D – fígado), não apresentam diferença significativa.
Figura 21. Volume da massa do tecido adiposo e do fígado
dos camundongos do grupo controle com zinco (n = 2) e do grupo controle sem zinco (n = 2), e do grupo obeso com zinco (n = 2) e do grupo obeso sem zinco (n = 2). (A) Volume da massa do tecido adiposo do grupo controle com zinco e do grupo controle sem zinco; (B) Volume da massa do fígado do grupo controle com zinco e do grupo controle sem zinco; (C) Volume da massa do tecido adiposo do grupo obeso com zinco e do grupo obeso sem zinco; (D) Volume da massa do fígado do grupo obeso com zinco e do grupo obeso sem zinco. Test t.
6. DISCUSSÃO
Devido a diversas interações diretas do zinco no metabolismo de carboidratos e lipídeos (WIJESEKARA, CHIMIENTI & WHEELER, 2009) e fato de que pacientes obesos apresentam baixas concentrações plasmáticas deste mineral (XANTHAKOS, 2009; KAIDAR-PERSON, 2008), foram realizados experimentos in vitro e in vivo na tentativa de elucidar o papel do zinco na adipogênese e no metabolismo de carboidratos em diferentes situações metabólicas. Vimos que in vitro, o zinco favorece a diferenciação celular (acúmulo de lipídeos intracelular) de células pré-adipócitas, e in vivo, reflete em menor ganho de massa corpórea após sobrecarga de carboidrato, melhorando as concentrações plasmáticas de adiponectina e reduzindo as de insulina.
A adipogênese é o processo de proliferação e de diferenciação do tecido adiposo. Para elucidar este processo in vitro, tem se utilizado células da linhagem 3T3-L1, que são pré-adipócitos do tipo fibroblástico, provenientes de embriões murinos (FONSECA- ALANIZ et al., 2007; QUEIROZ et al., 2009). Estas células tem sido extensivamente estudas. Filippin- Monteiro e colaboradores (2010) utilizaram estas células para identificar a ação inflamatória e a indução de resistência à insulina pela proteína inflamatória amiloide sérica A (SAA). Os autores verificaram que a presença dessa proteína impediu a diferenciação de pré-adipócitos evidenciado pelo menor acúmulo de triacilgliceróis intracelulares. Esta menor diferenciação foi comprovada pela diminuição da expressão de genes adipogênicos incluindo o gene que codifica o receptor GLUT4. Mais recentemente, Oliveira et al. (2015) utilizaram as células 3T3-L1
para examinar o efeito da triiodotironina (na ausência e em diferentes concentrações) sobre a expressão dos genes que codificam a leptina e a adiponectina em diferentes períodos de tempo a fim de avaliar a diferença de expressão entre as duas adipocinas.
Neste trabalho, verificou-se, inicialmente o processo de proliferação celular da 3T3-L1 na ausência e na presença de zinco. Como o objetivo não foi diferenciá-las, mas manter as características fibroblásticas sem acúmulo de lipídeos intracelulares, o meio de cultura que foi usada para plaquear as células, foi suplementado com 10% de CS, que contém abundantes fatores de crescimento. Estas células foram tratadas, com DMEM suplementado com 10% CS exposto a resina Chelex® e suplementada com zinco em diferentes
concentrações. Para garantir concentrações baixas de zinco nos soros de cultura celular (CS e SFB) que foram utilizados nestes experimentos, utilizou-se a resina Chelex® 100 que
captura esse mineral. A remoção do zinco com a resina foi eficaz reduzindo as concentrações de zinco nos soros em cerca de 80%. Essa eficácia é devido a seletividade que a resina tem para cátions divalentes em um pH de 6,5 ou superior. É uma resina que sequestra metais que mantém as concentrações de outros constituintes não metálicos dos soros de cultura intactos (REAVES et al.,2000).
Nos resultados obtidos na viabilidade celular de pré- adipócitos 3T3-L1 com azul de tripan, verificou-se um aumento na densidade celular das amostras suplementadas com zinco (2 µg/mL e 4 µg/mL) após 24 h de tratamento. Entretanto, na ausência deste metal, obteve-se discreta diminuição. Estes achados foram confirmados com análise morfológica por fluorescência, nas mesmas condições acima citadas. As sondas fluorescentes (laranja de acridina e brometo de etídio), marcadoras de morte celular, não evidenciaram morte celular por necrose ou apoptose na presença de zinco, tampouco na ausência deste. É possível que a realização da análise de viabilidade celular em um maior período de tempo de tratamento, como 36 ou 48 h,
poderia revelar um maior aumento na proliferação das células suplementadas com zinco. Tal hipótese foi levantada pelo fato de que na análise do ciclo celular por citometria de fluxo, obteve-se uma diminuição significativa da porcentagem de células na fase S quando na ausência de zinco. Ainda, observou-se um aumento significativo das células suplementadas com zinco nas concentrações de 2 µg/mL e 4 µg/mL na fase S do ciclo celular, onde ocorre a síntese de material genético, dos filamentos de cromatina, além da síntese de histonas e a duplicação dos centríolos, imprescindíveis para a proliferação celular (BEHL & ZIEGLER, 2014). Estes achados sugerem que o aumento da concentração de zinco estimula a progressão do ciclo celular, que por sua vez, aumenta a divisão celular, ou seja, estimula a proliferação celular.
A interferência do zinco na proliferação celular também foi relatada por Ghosh e colaboradores (2013), onde utilizaram o zinco quelado a vitamina C (ZNC) para verificar o potencial efeito deste sobre a proliferação e a citotoxicidade das células 3T3-L1 após 24 e 48 h de tratamento em diferentes concentrações (0, 0,012 e 0,025 mg/mL). Os autores verificaram que não houve diferença significativa entre os tratamentos, porém, observou-se um discreto aumento das células tratadas após 48 h, quando comparadas com as células sem o ZNC.
As células da linhagem 3T3-L1 também são utilizadas para avaliar a capacidade das células em amadurecerem de pré-adipócitos para adipócitos ricos em triacilgliceróis intracelulares. Este processo de amadurecimento consiste no desenvolvimento da capacidade de pré-adipócitos realizarem lipogênese (síntese de ácidos graxos) a partir da glicose captada do meio de cultura, por meio da insulina presente no meio de diferenciação (MDI). A presença de constituintes importantes no MDI garante o processo de diferenciação. A insulina, em concentrações farmacológicas (µM), liga-se ao
receptor do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1(IGF-1). Ainda no MDI, a dexametasona (DEX) ativa receptores glicocorticoides e a isobutilmetilxantina (IBMX) inibe fosfodiesterases competitivamente aumentando o cAMP intracelular. A junção destas diversas ações leva a ativação de eventos transcricionais essenciais para a diferenciação celular (FARMER, 2006). Os fatores de transcrição ativados neste processo são os C/EBP-β e C/EBF-δ (proteínas β e δ ligantes ao amplificador CCAAT) que ativam a expressão dos fatores de transcrição C/EBP-α e PPAR-γ.(receptor γ ativado por proliferadores de peroxissomas) que por sua vez, induzem transcrição de genes-alvos, incluindo enzimas e proteínas envolvidas na geração e manutenção do fenótipo do adipócito, como as envolvidas no transporte de glicose sensível à insulina, lipogênese, lipólise e síntese e secreção de adipocinas (FARMER, 2006; KIESS et al., 2008; FONSECA-ALANIZ et al., 2007; QUEIROZ et al., 2009; MERUVU, HUGENDUBLER & MUELLER, 2011).
Neste trabalho, os resultados da diferenciação celular mostram que houve um aumento da absorbância do eluato do corante para triacilglicerol intracelulares das células suplementadas com zinco (1 µg/mL, 2 µg/mL e 4 µg/mL), mostrando assim que houve uma maior proporção de células que se diferenciaram, nestas concentrações de zinco, em relação ao controle. Estes achados sugerem que a presença de zinco facilitou o acúmulo de triacilglicerol intracelular, possivelmente auxiliando na captação de glicose. Nossos resultados estão de acordo com o que foi pesquisado por Tanaka et al. (2001). No intuito de verificar se a suplementação de zinco no rebanho melhora a qualidade da carne bovina marmorizada, estes pesquisadores avaliaram a relação da concentração sérica de zinco e marmoreio ou atividade adipogênica, e também o efeito do zinco na diferenciação celular. Os autores utilizaram pré-adipócitos 3T3-L1 que foram cultivadas com 1 µM de cloreto de zinco, 5% de SFB, com ou sem 5 g/mL de insulina. Verificaram
que o zinco promovia a diferenciação destas células in vitro na ausência de insulina, e na presença de insulina, havia um maior aumento do processo. Estes achados devem-se, provavelmente, pelo fato de que o zinco estimula os receptores de insulina tirosina cinase, aumentando a translocação dos transportadores de glicose do tipo 4 (GLUT 4) para a membrana celular, aumentando assim, a captação de glicose pelas células, tal como a teoria de Marreiro e colaboradores (2002), que foi citada por Leão e Santos (2012). No trabalho de Myers e colaboradores (2013), o papel do Zip7, um tipo de transportador de zinco que regula a sua concentração citosólica, na regulação do controle glicêmico no músculo esquelético, foi verificado. Os autores utilizaram os mioblastos C2C12 e bloquearam o Zip com siRNA. Verificaram que houve uma redução da expressão do GLUT4 e a síntese de glicogênio estimulada por insulina foi diminuída. Isto foi associado com uma redução na expressão de mRNA de Insr, IRS1 e Irs2 (substratos do receptor de insulina) e a fosforilação da Akt, comparando com os resultados do controle.
Com o intuito de verificarmos o papel do zinco e sua ausência no metabolismo de carboidratos, realizou-se estudos in vivo utilizando-se camundongos Swiss webster, por serem espécies não isogênicas, se assemelhando com a adversidade populacional e por ser um bom modelo animal de indução de obesidade, tal como mostra o trabalho realizado por White e colaboradores em 2013. A dieta hiperlipídica e hipercalórica utilizada neste trabalho e o modelo animal de indução de obesidade foram testados. Para este teste, utilizou-se 9 camundongos de 6 semanas de vida, que foram divididos em grupo controle (GC, n = 4) que consumiu dieta normolipídica e grupo obeso (GO, n = 5) que consumiu a dieta hiperlipídica durante 5 semanas. Verificou-se que tanto a dieta como o modelo de obesidade foram apropriadas para este trabalho. Os animais do grupo grupo obeso (peso
final: 2,918% ± 0,387) não rejeitaram a dieta e tiveram um aumento significativo do peso quando comparação com o grupo controle (peso: 1,168 ± 0,231%).
Na fase de indução da obesidade, verificou-se um aumento significativo do peso, do índice de Lee e do consumo de ração no grupo obeso, em relação ao grupo controle. O consumo de ração é um aspecto crucial no estabelecimento de um modelo de obesidade, pois nem sempre resultados satisfatórios são alcançados. No trabalho realizado por Santos em 2013, o grupo que consumiu dieta hiperlipídica consumiu menos ração em comparação com os outros grupos, porém, a sua variação de peso e o índice de Lee foram maiores. Provavelmente, este aumento do consumo desta ração seja devido a presença de sacarose que a tornou mais palatável e o aumento de peso seja pela carga energética maior.
O modelo de indução da obesidade também foi avaliado quanto aos aspectos hematológicos e bioquímicos dos animais após os 3 meses. Os parâmetros hematológicos não sofreram alterações, mostrando assim que o grupo obeso não apresentou doença provocada pela dieta consumida, tal como anemia. Entretanto, nos parâmetros bioquímicos obteve-se uma diminuição na determinação de triacilglicerol do grupo obeso.
Uma vez estabelecido o modelo de indução da obesidade, a etapa seguinte consistiu na subdivisão dos grupos grupo obeso e grupo controle em dois grupos, perfazendo um total de quatro grupos. Dois grupos receberam sobrecarga de carboidratos com concentrações adequadas de zinco (grupo controle com zinco e grupo obeso com zinco) e os outros dois, sobrecarga de carboidratos em condições de deficiência de zinco (grupo controle sem zinco e grupo obeso sem zinco).
Na fase de sobrecarga de carboidratos, os grupos em condições de deficiência de zinco, tanto obesos quanto não obesos, mostraram um aumento na variação da massa corpórea. Os grupos que receberam zinco perderam massa
corpórea de maneira significativa. No intuito de estudar a relação entre o zinco e a obesidade, Bock e colaboradores, em 1995, avaliaram os resultados da adiposidade de ratos que receberam uma solução de sacarose a 32% e uma dieta com baixo teor de zinco, em relação com os animais que receberam a mesma solução, porém com depleção de zinco. Foi verificado que o grupo que recebeu baixo teor de zinco desenvolveu maior adiposidade em relação ao grupo que recebeu zinco (BOCK, 1995). No presente trabalho, as alterações da massa corpórea dos animais de todos os grupos foram confirmadas com a determinação do índice de Lee. Não foi observada diferença significativa entre os grupos controle (grupo controle com zinco e o grupo controle sem zinco) e os grupos obesos (grupo obeso com zinco e o grupo obeso sem zinco). Nesta fase do experimento, os parâmetros hematológicos também não apresentaram alterações nos quatro grupos mesmo com as alterações de ração ou gavagem diária.
Uma das características da obesidade é quadro inflamatório crônico e o aumento do tecido adiposo, levando assim, a secreção de citocinas pró-inflamatórias e a redução de citocinas anti-inflamatórias levando a uma disfunção metabólica. A insulina, a leptina e a adiponectina são marcadores importantes da obesidade. Neste quadro a concentração de insulina e a leptina encontram-se elevadas e a concentração da adiponectina reduzida (SILVA et al., 2003). Neste trabalho também foi avaliado a concentração de insulina, leptina e adiponectina, e na fase de sobrecarga de carboidrato, também foi avaliado o volume da massa do TA e do fígado. Verificamos que na fase da indução de obesidade, não houve diferença na concentração de adiponectina e de leptina entre os grupo controle e o grupo obeso. Porém, o grupo obeso apresentou uma concentração de insulina maior que o grupo controle. E na fase da sobrecarga de carboidratos, verificamos que o grupo controle com zinco apresentou um aumento na concentração de adiponectina, e uma diminuição da concentração de leptina,
em relação ao grupo controle sem zinco; e os grupos obeso não apresentara diferenças.
No trabalho do Santos em 2013, foi estudada a função de macrófagos peritoniais de camundongos Swiss submetidos à dieta hipoprotéica e hiperlipídica. Os camundongos foram separados em três grupos: controle, hipoprotéico e hiperlipídico. Além de avaliar o quadro nutricional, o TA e a função dos macrófagos peritoniais, foram avaliados também as concentrações séricas de leptina, adiponectina e insulina. Observou-se não haver alteração na concentração de insulina entre o grupo controle e o grupo hiperlipídico. Na concentração de leptina observaram concentrações mais elevada no grupo hiperlipídico em comparação com o controle, e as concentrações de adiponectina estavam reduzidas em relação ao grupo controle.
Observamos que o volume da massa do TA, na primeira fase foi significativamente maior no grupo obeso. E na segunda fase, não houve diferença significativa entre o gripo controle com zinco e o grupo controle sem zinco, e entre o grupo obeso com zinco e o grupo obeso sem zinco.
7. CONCLUSÃO
Neste contesto, concluímos que o zinco promoveu a proliferação e a diferenciação celular de adipócitos 3T3-L1, e a progressão do ciclo celular evidenciado pelo maior proporção de células na fase S. Ainda, a presença de zinco facilitou o acúmulo de triacilgliceróis intracelulares em pré- adipócitos 3T3-L1. Além disso, a ausência de zinco promoveu a perda da capacidade das células se diferenciarem, provavelmente pela diminuição da captação de glicose.
O modelo murino de indução da obesidade (Swiss) se mostrou eficiente devido ao ganho de massa corpórea, aumento da adiposidade e aumento da concentração de insulina sem promover alterações relevantes nos parâmetros