O isolamento dos microssomas hepáticos e a realização dos ensaios catalíticos foram realizado em colaboração com o grupo de pesquisa do Prof. Dr. Anderson Rodrigo Moraes de Oliveira da FFCLRP-USP. Os microssomas foram obtidos através de centrifugações sucessivas de homogenato de fígados de ratos Wistar, seguindo metodologia descrita por Santos (2006). Os microssomas foram incubados em tubos de ensaio de 10mL mantidos a 37◦C e em agitação. Os tubos testes continham 650µL de tampão fosfato (pH 7,4), 100µL dos microssomas (conc. final de 2mg/mL determinado atraves do método do biureto (GORNALL; BARDAWILL; DAVID, 1949), 25µL de substrato (1.5mg/mL) , 100µL dos cofatores NAD+ e glucose 6-fosfato e 50µL de glucose 6-fosfato-deshidrogenase. Após a adição da suspensão de microssomas, a reação foi incubada por 1.5h e então foram interrompidas pela adição de 3 x 4mL de AcOEt. Os tubos foram centrifugados e o sobrenadante foi seco e a ele foi adicionado 50µL do reagente derivatizante e 150µL de piridina anidra, aquecidos a 75◦C por 20min e analisados por CG-EM utilizando o método 1 de análise descrito na seção 3.3.2. Foram utilizados dois controles, um deles incubado sem a presença do substrato e outro sem a presença dos cofatores.
19
4
RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1
Isolamento do ácido caurenoico a partir de Copaifera
ssp
A primeira matriz utilizada para o isolamento do ácido caurenoico foi a fração fixa das resinas de copaíba. Esta fração foi purificada utilizando coluna clássica de sílica e uma mistura de Hexano:AcOEt 99:1 como fase móvel. Foram recolhidas 10 frações de 500mL, sendo as frações 3-7 foram analisadas em CCDC de acordo com método utilizado na seção 3.3.1 e apresentaram manchas roxas de Rf 0,3. As análises de CCDC foram realizadas concomitantemente à eluição da coluna, e assim que os compostos de interesse não foram mais detectados, a coluna foi interrompida com a eluição de 2L de MeOH.
Após sucessivas recristalizações com MeOH grau HPLC foram obtidos dois sólidos compostos por misturas do ácido caurenoico e do ácido cauranoico, sendo este último já isolado no gênero Copaifera, nas espécies Copaifera paupera (TINCUSI et al., 2002) e Copaifera langsdorfii (FERRARI et al., 1971) . Após análise por CG-EM, a primeira mistura apresentou sinais cromatográficos com proporção de 4:1 de ácido caurenoico e ácido cauranoico(230mg) figura 4.1A, e a segunda apresentou maior proporção do ácido cauranoico (1:1)figura 4.1B. Foram adquiridos os dados de RMN de1H,13C e DEPT 135 da mistura 1:1 mostrada na Figura 4.1. Os espectros estão ilustrados nos Anexos A e B. A estrutura do ácido cauranoico pode ser sugerida com base no perfil de fragmentação observado no seu espectro de massas. Os primeiros cinco íons do espectro do ácido cauranoico (304, 289, 271 e 259) também apareceram no espectro do ácido caurenoico com diferença de 2u confirmando a ausência da ligação dupla (Figura 4.3).
Para confirmar a hipótese da presença do ácido cauranoico na mistura foi realizada uma operação de subtração entre os espetros de 1H da mistura ácido caurenoico:ácido cauranoico e o espectro de1H do ácido caurenoico puro isolado posteriormente. O resul- tado é mostrado na figura 4.2. Pode-se notar um dubleto em δ= 1,01 ppm e J = 7 Hz,
4.1 Isolamento do ácido caurenoico a partir de Copaifera ssp 20
Figura 4.1: Cromatograma dos produtos isolados a partir de resinas de Copaifera ssp.
que correspondeu aos valores encontrados por Ferrari et al. (1971) ( δ=1,04ppm, J = 6 Hz).
Como o acesso às frações fixas do óleo de copaiba foi dificultado, e o produto obtido requer etapas complementares de isolamento para a separação do ácido cauranoico do ácido caurenoico, foi avaliada outra matriz que pudesse fornecer quantidades suficientes de substrato para este estudo. Esta matriz deve ser de fácil e abundante coleta e ter como metabólito majoritário o ácido caurenoico.
4.1 Isolamento do ácido caurenoico a partir de Copaifera ssp 21
Figura 4.2: Espectro resultante da subtração do espectro de 1H da mistura ácido cau- ranoico:ácido caurenoico com o espectro de 1H do ácido caurenoico puro
Figura 4.3: Espectro de massas dos produtos isolados a partir de resinas de Copaifera
4.2 Isolamento do ácido caurenoico a partir de Wedelia paludosa 22
4.2
Isolamento do ácido caurenoico a partir de Wedelia
paludosa
O fracionamento em coluna foi acompanhado por cromatografia em fase gasosa e os resultados estão mostrados na figura 4.4. Comparando o perfil de fragmentação do ácido
Figura 4.4: Cromatogramas obtidos por CG-EM das frações purificadas por CLV do
material de partida (extrato hexânico WPH1) e espectro de massas do sinal com tempo de retenção de 16,7 min correspondente ao ácido caurenoico derivatizado
caurenoico derivatizado (TMS) com o disponível na biblioteca do Núcleo de Pesquisas em Produtos Naturais e Sintéticos-FCFRP-USP foi possível identificar a presença desta substância no extrato. As frações Hex:AcOEt 9:1 e Hex:AcOEt 9:2 mostraram a presença deste composto, mas também outros contaminantes. Estas frações foram reunidas e la- vadas com EtOH gelado para a precipitação de substâncias de menor polaridade. Este precipitado foi descartado.
A fração solúvel em EtOH foi então seca em fluxo de nitrogênio, dissolvida em uma mistura MeOH:AcOEt 1:1 e cromatografada utilizando Sephadex-LH20 como fase esta-
4.2 Isolamento do ácido caurenoico a partir de Wedelia paludosa 23 cionária e MeOH:AcOEt 1:1 como fase móvel. Após análise por CCDC as frações 20-24 apresentaram manchas roxas com Rf 0,3. Estas amostras foram recristalizadas utilizando metanol e a fração 23 resultou em 178mg de ácido caurenoico com pureza cromatográfica de 99% e valor de rotação específica αD de -97,5◦(c.10mg/mL, 28◦C) A figura 4.5 mostra o seu cromatograma. Para a confimação da identidade química do ácido caurenoico foram
Figura 4.5: Cromatograma e espectro de massas do ácido caurenoico obtido após puri-
ficação em coluna
adquiridos dados de1H e 13C RMN. Os valores encontram-se na tabela 4.1 e 4.2.
Tabela 4.1: Dados de 1H-RMN do produto isolado e valores da literatura
Hidrogênio Ácido cau- renoico
isolado(ppm)
Batistaet. al.,2007(ppm) Silvaet. al.,1999(ppm)
13 2,64(1H,m) 2,64(1H,m) 2,62(1H,m)
17a 4,80(1H,s) 4,79(1H,s) 4,78(1H,s)
17b 4,74(1H,s) 4,73(1H,s) 4,72(1H,s)
18 1,25(3H,s) 1,24(3H,s) 1,23(3H,s)
4.3 Metodologias analíticas 24
Tabela 4.2: Dados de13C-RMN do produto isolado e valores da literatura
Carbono Ácido cau- renoico
isolado(ppm)
Batista et. al.,2007(ppm) Silva et. al.,1999(ppm)
1 41,1 40,7 40,7 2 19,5 19,1 19,1 3 38,2 37,7 37,7 4 44,1 43,2 43,2 5 57,5 57,1 57,0 6 22,2 21,8 21,8 7 41,7 41,3 41,3 8 44,6 44,2 44,2 9 55,5 55,1 55,1 10 40,1 39,7 39,7 11 18,8 18,4 18,4 12 33,5 33,1 33,1 13 44,3 43,8 43,8 14 40,1 39,7 39,7 15 49,3 48,9 48,9 16 156,3 155,9 155,8 17 103,4 103,0 103,0 18 29,4 29,0 28,9 19 184,9 184,8 184,9 20 16,0 15,6 15,6
4.3
Metodologias analíticas
O estudo da oxidação de terpenos apresenta algumas dificuldades em relação à meto- dologia de análise do substrato e dos produtos. Particularmente para o ácido caurenoico, a ausência de grupos cromóforos com absorção em regiões acima de 230nm resulta em baixos limites de quantificação para a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) acoplada a detector de ultravioleta(UV). Entretanto, alguns autores descreveram o uso desta técnica para a determinação do teor de ácido caurenoico em diferentes ma- trizes com valores de limite de detecção inferiores a 1µg. Os detalhes e limitações destas técnicas serão apresentadas a seguir.
Batista, Braga e Oliveira (2005) desenvolveram uma metodologia para a quantificação de ácido caurenoico e ácido grandiflorênico em partes aéreas de W. paludosa utilizando CLAE acoplado um detector de ultravioleta (UV) em 220nm e uma mistura de aceto- nitrila:água 6:4 em modo isocrático. Foi encontrado o limite de quantificação de 1,25µg para o ácido caurenoico e 0,65µg para o ácido grandiflorênico no entanto, a resolução de
4.3 Metodologias analíticas 25 ambos os sinais apresentou valores de resolução abaixo de 1, o que pode indicar que os sinais não estão totalmente separados e outros componentes da matriz.
Bertolucci et al. (2009) desenvolveu uma metodologia utilizando CLAE-UV para a quantificação de ácido caurenoico, ácido o-cumárico, ácido benzoilgrandiflórico e ácido cinamoilgrandiflórico, presentes em folhas de Mikania laevigata e Mikania glomerata. O limite de quantificação para o ácido caurenoico foi de 0,8µg utilizando o detector UV em 230nm e houve boa separação entre os sinais adjacentes. Embora os valores dos limites de quantificação não impeçam o uso de métodos por CLAE para o presente es- tudo, optou-se pela utilização da técnica de cromatografia em fase gasosa. Esta opção se deu principalmente pela possibilidade de acoplamento do sistema cromatográfico com o detector de espectrometria de massas com ionização por elétrons, que pode fornecer informações estruturais importantes sobre os terpenos analisados. Além disso, o uso de colunas cromatográficas mais longas em cromatografia em fase gasosa permite uma maior eficiência na separação cromatográfica possibilitando a detecção de produtos de oxidação estruturalmente semelhantes.
Utilizando a técnica de cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas foi inicialmente desenvolvida a metodologia 2 descrita na tabela 3.3, seção 3.3.2. A utilização deste método resultou em um sinal para o ácido caurenoico pouco simétrico e com cauda, conforme mostrado na figura 4.6
De acordo com estudos prévios, derivados hidroxilados podem ser obtidos na oxidação do ácido caurenoico. Os trabalhos de Marquina et al. (2009) , Silva et al. (1999) e Tave- epanich et al. (2010) descreveram a obtenção de derivados mono-, di- e tri-hidroxilados em reações de biotransformação utilizando fungos. A presença deste grupamento poderia aumentar a retenção do ácido caurenoico, resultando em um sinal mais assimétrico e com baixa resolução. Foi desenvolvida, então, uma metodologia de derivatização para a análise utilizado o reagente N,O-bis(trimetilsilil)trifluorocetamida (BSTFA). O BSTFA é capaz formar derivados trimetilsililados em compostos que possuem hidrogênios ácidos como ácidos carboxílicos, alcoois, fenóis, aminas primárias e secundárias (WATSON; SPARK- MAN, 2008). Os sinais cromatográficos de produtos trimetilsiliados apresentam menor formação de cauda, e maior resolução. Além disso, como o BSTFA não reage com éteres, cetonas e epóxidos, este método de análise permite diferenciar os produtos hidroxilados e epoxidados, que serão isômeros, pelo valor da massa molecular do produto derivatizado. Epóxidos resultarão em um sinal com um incremento de 88u [M-H+SiCH3+16(O)] cor-
4.3 Metodologias analíticas 26
Figura 4.6: Cromatograma representativo da análise por CG-EM de uma reação sem
derivatização
hidroxilados resultarão em um incremento de massa de 160u [M-2H+2(SiCH3)+16(O)]
correspondente a derivatização do grupamento ácido mais o grupamento hidroxil.
A figura 4.7 mostra um cromatograma onde foi utilizado a metodologia de análise sem a derivatização (A) e com derivatização (B). O material analisado foi obtido após reação utilizando o catalisador FeTFPP e PhIO como oxidante na proporção catalisador, oxidante, substrato, de 1:60:40 e tendo como solvente DCM. O tempo reacional foi de 24h. Pode-se observar que não é possível a definição de nenhum sinal analítico quando o meio não é derivatizado. Uma possível causa é a baixa volatilidade de derivados caurânicos hidroxilados, ou mesmo o aumento da assimetria dos sinais após a oxidação. Já o cro- matograma do meio derivatizado apresenta sinais bem resolvidos e com pouca formação
4.4 Caracterização dos produtos de oxidação do ácido caurenoico 27 de cauda. Portanto, para todos os experimentos subsequentes os meios reacionais foram analisados utilizando o método 1 descrito na tabela 3.2 seção 3.3.2.
Figura 4.7: Cromatograma representativo da análise do ácido caurenoico sem derivati-
zação (A) e com derivatização (B)
4.4
Caracterização dos produtos de oxidação do ácido
caurenoico
Após análise por CG-EM foram encontrados diversos sinais com tempo de retenção superior ao do ácido caurenoico. No entanto, somente três destes produtos estão relaciona- dos com produtos de oxidação do ácido caurenoico. A figura 4.8 mostra um cromatograma representativo com a indicação dos produtos encontrados. A identificação da estrutura química de cada um dos produtos foi proposta através do perfil de fragmentação dos sinais cromatográficos encontrados e é apresentada abaixo.
4.4 Caracterização dos produtos de oxidação do ácido caurenoico 28
Figura 4.8: Cromatograma representativo da análise por CG-EM de uma reação de
oxidação
Como não existem dados da literatura a cerca dos seus possíveis produtos de meta- bolismo em humanos, foram buscados sinais cromatográficos correspondentes a perfis de fragmentação com semelhança aos de diterpenos e também sinais correspondentes a pro- dutos de oxidação já observados em outras reações, envolvendo fungos (TAVEEPANICH et al., 2010; PECHWANG et al., 2010) e oxidantes como o MCPBA (BATISTA et al., 2007).
Em 1971 Kalinovskii et al. (1971) realizaram um estudo sistemático sobre fragmenta- ção do ácido caurenoico e derivados utilizando a espectrometria de massas com ionização por elétrons. Esse trabalho pioneiro revelou que os diterpenos caurânicos apresentam frag- mentos típicos como a eliminação de um metil radical (-15 u), e eliminações com perdas de 43 e 59u, todas a partir do íon molecular. O espectro do produto di-deuterado no carbono C17 revelou, como esperado, a mesma eliminação de 15u a partir do íon molecular relativa
4.4 Caracterização dos produtos de oxidação do ácido caurenoico 29 eliminações de 45 e 61u confirmando a eliminação de parte dos carbonos do anel D. Esses dados permitiram aos autores sugerirem que os íons [M-43].+ e [M-59].+ podem resultar de clivagens entre os carbonos C17-C16 ou ainda entre os carbonos C8-C15 e C13-C16 en-
volvendo uma quebra complexa que não foi totalmente elucidada no estudo. Em relação às análises do ácido caurenoico derivatizado com BSTFA devemos levar também em con- sideração fragmentações específicas do derivatizante. Para os produtos derivatizados de ácidos carboxílicos com BSTFA, podem ocorrer eliminações de metil radicais do derivado trimetilsililado formado um íon siloxônio (Figura 4.9-A). A descarboxilação subsequente do íon de m/z 359 origina um carbocátion terciário de m/z=257 (Figura 4.9).
Os sinais de m/z próximos a 100 no espectro do produto derivatizado (Figura 4.11) parecem resultar de uma clivagem do anel B do esqueleto caurânico. De acordo com a figura 4.9-B a quebra das ligações entre os carbonos C9-C10 e a clivagem subsequente
entre os carbonos C5-C6 ou C6-C7 resultam nos íons A (A1 m/z= 148 e A2 m/z=109) e
os íons B (B1 m/z= 135 e B2 m/z= 123. Apesar da possível racionalização desses íons, sua baixa intensidade e a maior ocorrência de sinais sobreponíveis nessa região torna sua interpretação um pouco mais complicada e portanto, os íons destacados na porção A da figura 4.9-A são os mais úteis para a análise dos derivados.
Figura 4.9: Proposta de fragmentação do ácido caurenoico
O perfil de fragmentação dos produtos 3 a 5 compartilha algumas clivagens semelhan- tes ao do ácido caurenoico sililado 2 (Figura 4.11). Todos eles apresentam um pico base de
4.4 Caracterização dos produtos de oxidação do ácido caurenoico 30
m/z=73, que indica a presença de um produto derivatizado, além do sinal M-15, da perda
do radical metil do grupo trimetilsilil. Os produtos 3 e 4 tiveram sua estrutura proposta com base no valor do íon molecular encontrado, m/z=390 e m/z=462 respectivamente. Estes dois valores de massa correspondem ao ácido caurenoico epoxidado e hidroxilado e dados de espectrometria de massas em alta resolução dos produtos não derivatizados (isômeros) confirmaram a fórmula molecular com erros inferiores a 5ppm . Portanto, os valores dos íons em alta resolução somado aos valores dos íons moleculares relativamente intensos dos derivados sililados observados nas análises de CG-EM, permitem sugerir as estruturas químicas propostas sem, no entanto, ser possível a determinação da posição da hidroxilação.
De acordo com o esquema da figura 4.9 já era esperada a eliminação de 15 do derivado epoxidado(3) formando o íon de m/z=375. A subsequente descarboxilação do íon [M- 15]·+originou o sinal em m/z 273, como apresentado para o ácido caurenoico derivatizado (figura 4.11 estrutura 2). Nessa mesma figura observamos que a fragmentação do produto
3 também resulta na eliminação de 43u gerando o íon de m/z=331 de forma análoga à
proposta para o ácido caurenoico Kalinovskii et al. (1971), o que estaria de acordo com a formação do epóxido na posição da insaturação.
Em relação ao produto hidroxilado a posição da hidroxilação não pode ser determi- nada por espectrometria de massas, especialmente devido a baixa intensidade dos sinais característicos de quebras dos anéis C e D do esqueleto caurânico, como os íons m/z 148 e m/z=135 do espectro de massas do ácido caurenoico. Contudo, os estudos com frações microssomais, que serão apresentados a seguir e na seção 4.7 mostram que esse produto não é formado e portanto, não se justifica um maior detalhamento.
Para o produto 5 o íon m/z= 449, que é o pico base, foi proposto como sendo resultante da clivagem do tipo beta de um dos grupamentos trimetilsilil. A proposta de fragmentação está esquematizada na figura 4.10. Este tipo de clivagem também ocorre no análogo não-derivatizado, o ácido-16,17-dihidroxicaurenoico, onde o sinal m/z=305[M-CH3)(O)]·+
apresentou-se como o pico base nas análises de espectrometria de massas conduzidas por Hsieh et al. (2004) e Herz e Kulanthaivel (1984).
O produto 5 também foi encontrado na reação de metabolismo utilizando microssomas de ratos, demonstrando a capacidade destes catalizadores de realizar reações análogas às observadas in vitro. Para este produto foram adquiridos dados de espectrometria de mas- sas com ionização por eletrospray em alta resolução e também foi realizado experimentos de espectrometria sequencial com dissociação induzida por colisão. Estes experimentos
4.4 Caracterização dos produtos de oxidação do ácido caurenoico 31
Figura 4.10: Proposta de fragmentação do composto 5
indicaram a presença de um sinal de m/z= 335,2215 que corresponde a fórmula molecular do ácido di-hidroxicaurenoico desprotonado com erro de 2ppm. As análises de massas sequenciais não forneceram dados conclusivos devido a baixa fragmentação do ácido cau- renoico em eletrospray, conforme exposto na seção 4.7. Os dados de espectrometria de massas indicam que a identidade deste produto formado tanto nas reações utilizando me- taloporfirinas como nas reações envolvendo microssomas de ratos pode de ser um derivado di-hidroxilado. A formação inicial do epóxido na insaturação corrobora para a localização dos dois grupamentos vicinais como será discutido posteriormente nesse trabalho.
4.5 Catálise homogênea 32
Figura 4.11: Propostas de estruturas químicas e espectros de massas dos produtos
observados após análise por CG-EM