A reação de síntese de biodiesel ocorre apenas na presença de catalisador da reação, em que diversos sistemas catalíticos podem ser empregados (Marchetti et al., 2007). A rota tecnológica mais utilizada para a produção do biodiesel tem sido a catálise alcalina homogênea por apresentar maior rendimento de reação, porém neste método convencional a remoção destes catalisadores do produto final requer uma grande quantidade de água de lavagem, além disso, o emprego de hidróxido de sódio e potássio exige matéria prima de baixa acidez para evitar a formação de sabão. O catalisador ácido é mais lento, podendo levar à formação de subprodutos indesejáveis de difícil separação (Robles-Medina et al., 2009; Fukuda et al., 2001).
Enzimas lipolíticas (biocatalisadores) vêm sendo estudadas como uma opção de catalisador para aplicação na síntese de biodiesel, por serem estáveis às condições de reação
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e serem favoráveis em termos ambientais e ainda exigirem condições brandas de reação (Lee et al., 2013). Além disso, as lipases são catalisadores que competem com ácidos e bases, por serem eficientemente aplicáveis em uma grande variedade de substratos para a síntese enzimática de biodiesel, inclusive material de baixa qualidade (alto teor de ácidos graxos livres), o que significa a possibilidade de utilização de óleos não comestíveis para o processo de produção do biodiesel (Brusamarelo et al., 2010). A principal vantagem do processo enzimático é que os ácidos graxos livres podem ser eficientemente transformados em biodiesel, e o glicerol recuperado com qualidade. Estas enzimas são capazes de catalisar reações de hidrólise, esterificação e transesterificação (Gog et al., 2012; Nielsen et al., 2008).
Lipases (triacilglicerol éster hidrolase, E C 3.1.1.3), abrangem um grupo de enzimas hidrolíticas que atuam tanto em meio aquoso (hidrólise de óleos e gorduras, com a liberação de ácidos graxos, diacilgliceróis, monoacilgliceróis e glicerol) como em meio orgânico (esterificação e transesterificação em meios com teor de água restrito). As lipases apresentam um mecanismo de atuação característico; seu sítio ativo é formado por uma tríade catalítica constituída pelos aminoácidos serina, ácido aspártico (ou glutâmico) e histidina, os quais também são encontrados em serina proteases. Entre as razões para o enorme potencial biotecnológico de lipases microbianas incluem-se o fato de elas serem estáveis em solventes orgânicos, não necessitarem de cofatores, possuírem uma grande especificidade de substrato e exibirem uma alta enantiosseletividade (Jaeger e Reetz, 1998). As lipases apresentam o fenômeno de atividade interfacial o que lhe confere poder catalítico em presença de interface lipídeo-água. A explicação para este comportamento é que as lipases apresentam uma tampa que cobre o seu centro catalítico, estrutura esta
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presente na maioria das lipases, e quando em presença de interfaces esta tampa se abre modificando a configuração da lipase de fechada para aberta, deixando o sítio ativo acessível e expondo sua grande superfície hidrofóbica a qual facilita a união da lipase à interface (Jaeger e Reetz, 1998). Algumas características de enzimas naturais podem ser melhoradas através de modificações genéticas, dentre as quais o aumento no intervalo de temperatura de reação, estabilidade durante utilização industrial, por exemplo, devido à degradação natural das enzimas. Além disso, as reações de conversão catalisadas por lipases requerem fácil ligamento e desligamento da enzima nos sítios ativos dos substratos, sendo que a taxa de reação normalmente é controlada pela acessibilidade aos centros catalíticos. Baixas taxas de reação são geralmente observadas em processos catalisados por lipases. O aumento da velocidade de reação é, portanto, essencial para o sucesso de lipases industriais. A maioria das lipases naturais tem evoluído para atingir um tipo específico de substrato com comprimentos de cadeia definidos, ao passo que para os processos industriais a adaptabilidade a várias matérias primas com composições distintas é desejável. Para ser comercialmente competitiva, uma lipase natural tem de ser redesenhada para possuir características desejáveis em todos os aspectos mencionados (Moltalbán, 2012).
O alto custo das lipases e a taxa de reação relativamente lenta são os principais obstáculos para a produção enzimática de biodiesel frente aos processos químicos convencionais. A imobilização enzimática é empregada na maioria dos casos, pois facilita a separação e purificação do biodiesel após a transesterificação. Em solução, moléculas de enzimas solúveis comportam-se como qualquer outro soluto, sendo facilmente dispersas em solução e possuindo total liberdade de movimento. Imobilização enzimática é uma técnica especificamente desenvolvida para restringir fortemente a liberdade de movimento de uma
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enzima, com retenção de sua atividade catalítica. Com isso, os biocatalisadores podem ser utilizados repetidamente em bioprocessos que utilizam diferentes configurações de reatores (bateladas, semicontínuos ou contínuos). Além de proporcionar maior estabilidade à enzima, a possibilidade de reutilização da enzima é essencial do ponto de vista econômico. A escolha de uma metodologia adequada de imobilização onde se obtenha um derivado imobilizado altamente estável, ativo e seletivo e que permita sua reutilização, é uma das principais chaves para a aplicação de enzimas a nível industrial (Robles-Medina et al., 2009).
Devido ao alto custo e baixa estabilidade das enzimas, para sua viabilidade para aplicação em processos industriais, é necessário algumas estratégias para aumentar sua estabilidade além de possibilitar sua reutilização. Neste sentido a imobilização da enzima em suportes sólidos é a alternativa para o emprego destes biocatalisadores industrialmente. Dentre os métodos de imobilização enzimática a técnica de adsorção é a mais simples e está baseada em uma interação por atração hidrofóbica, outra vantagem é que nesta técnica de imobilização a enzima fica adsorvida na sua conformação aberta, podendo-se obter derivados com atividades superiores (Mateo et al., 2007). Segundo a literatura as lipases são fortemente adsorvidas em interfaces hidrofóbicas, e por essa razão essas interações têm se tornado o método mais tradicional para imobilização de lipases e escolha de diferentes suportes (Liu et al., 2012).
A maioria das lipases produzidas por micro-organismos são extracelulares e produzidas por Mucor miehei, Rhizopus oryzae, Candida antarctica e Pseudomonas
cepacia. Muitas são purificadas e comercializadas na forma livre e imobilizada e destinadas
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a reação de catálise enzimática para produção de biodiesel é principalmente influenciada pela temperatura, agitação, conteúdo de água e razão metanol/óleo, sendo estas as principais variáveis que devem ser estudadas durante a reação de síntese de biodiesel (Gog et al., 2012).
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CAPÍTULO III
CULTIVATION OF Candida sp. LEB-M3 IN GLYCEROL: LIPID ACCUMULATION AND PREDICTION OF BIODIESEL QUALITY PARAMETERS
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CULTIVATION OF Candida sp. LEB-M3 IN GLYCEROL: LIPID
ACCUMULATION AND PREDICTION OF BIODIESEL QUALITY
PARAMETERS
Susan Hartwig Duarte1, Marina Ansolin2 and Francisco Maugeri1
1
Laboratory of Bioprocess Engineering, Faculty of Food Engineering - UNICAMP, Campinas, Brazil.
2
Laboratory of Extraction, Applied Thermodynamics and Equilibrium - UNICAMP,
Campinas, Brazil.
ABSTRACT
The quality of biodiesel from lipids produced by the yeast Candida sp. LEB-M3 was predicted by the use of mathematical models for parameters that specify quality as a function of the fatty acid profile. The lipid production was studied according to the Experimental Design methodology, for different cultivation conditions for agitation and aeration. Lipidic compositions were affected by the cultivation conditions and the agitation presented a positive effect for the formation of monounsaturated fatty acids and negative effect for saturated fatty acids. Aeration had a positive effect on the formation of polyunsaturated fatty acids. According to the predictions by the mathematical models, the cetane number varied from 61-67, the oxidative stability from 11-17 hours, the iodine index from 55-75 gI2/100g, density from 852-868 Kg/m3. All cultivation conditions led to lipid compositions, whose predicted bioparameter values indicate that biodiesel from this lipid source should present current standard quality.
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3.1 INTRODUCTION
Political policies incentivizing biodiesel consumption have resulted in increased production of this biofuel, which arose from the need to replace exhaustible fossil fuel energy sources (Ayoub and Abdullah, 2012). Biodiesel represents an environmentally safe alternative fuel and its main raw material is vegetable oil. However, the production of large quantities of vegetable oil requires large areas of arable land, increasing the competition for space with other food crops. In this context it is important to search for alternative sources of lipid materials for biodiesel production (Saenge et al., 2011; Marchetti et al., 2007).
Most microorganisms are able to synthesize fatty acids as precursors of essential cell components at high synthesis rates (Liu et al., 2013). Lipids produced by yeasts are potential alternative feedstock for biodiesel production. Oleaginous yeasts present the ability to accumulate more than 20% of their biomass into lipids formed mainly of triacylglycerols that have fatty acid compositions similar to those present in vegetable oils (Ratledge, 2005), and therefore can be used in the transesterification reaction to synthesizing a mixture of fatty acid methyl esters (FAMEs), commercially known as biodiesel.
The increased availability and reduced cost of crude glycerol, the main co-product of biodiesel, resulting from the growing production of this biofuel has attracted the attention of researchers. Several studies have focused on adding value to this co-product by using it as a substrate for microbial cultures in biotechnological processes (Kitcha and Cheirsilp, 2013; Duarte et al., 2013a, 2013b; Silva et al., 2009). Lipid accumulation by yeasts occurs in high concentrations of the carbon source, besides a certain amount of
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nitrogen is required to maintain metabolic activity of the microorganism (Ratledge, 2005). Inexpensive and renewable sources of these compounds, such as some agro-industrial byproducts, are alternatives that may also provide other important nutrients for cultivation of microorganisms.
Among the parameters evaluated in the microbial production of lipids, it is important to consider not only the total quantity of lipids accumulated, but also the quality of the fatty acids synthesized during cultivation. In accordance with the microorganism species, carbon source, carbon/nitrogen ratio (C/N) and other cultivation conditions, variations in the type of fatty acids generated may occur, since these variables play an important role in lipid content and composition, which thus have an influence on the biodiesel produced (Dey et al., 2011; Easterling et al., 2009). The suitability of microorganism-based biodiesel for application as a fuel must follow certain requirements, as with traditional biodiesel, and must comply with the specifications of some parameters stipulated by current standards. These parameters may be influenced by the individual characteristics of fatty acid methyl esters (FAME), according to the structure of the constituent fatty acids. When the fatty acids have little or no unsaturation, for example C16:0, C18:0, C18:1, C18:2 and C18:3, they are suitable for the production of biodiesel; on the other hand, when rich in polyunsaturated fatty acids with four or more unsaturations, they become limiting due to their susceptibility to oxidation (Dey et al., 2011; Gopinath et