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Causas de marcação inespecífica 5

No documento Imunohistoquímica (páginas 98-104)

9 RECUPERAÇÃO ANTIGÉNICA

10.5 Causas de marcação inespecífica 5

IMUNOHISTOQUÍMICA INIBIÇÃO DE PARTÍCULAS ENDÓGENAS

88 B. Interações iónicas.

C. Atividade enzimática endógena. D. Anticorpos naturais. E. Anticorpos contaminantes. F. Difusão antigénica. G. Reações cruzadas. H. Recetores Fc. I. Outros: a. Tecido necrosado b. Fixação deficiente c. Má desparafinação

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11 IMUNOCITOQUÍMICA

11.1 Enquadramento histórico

Tal como foi referido no início deste documento, considera-se imunocitoquímica o conjunto de metodologias que usam imuno-ensaios para co-localizar um epítopo de interesse em esfregaços citológicos, preparações citocentrifugadas (e.g. cytos-

pin™) ou preparações monocamada (e.g. thinprep®)1.

Em 1980, Nadji descreveu as potencialidades do diagnóstico imunocitoquímico, criando um método de imunoperoxidase ligeiramente modificado que aplicou em amostras de citologia aspirativa e esfoliativa, no sentido de avaliar a histogénese de células neoplásicas e diferenciar populações linfóides reativas e neoplásicas. Verificou que a técnica era exequível, permitindo uma boa morfologia, o que lhe pareceu justificar uma mais ampla aplicação desta metodologia no diagnóstico ci- tológico de rotina106.

Por sua vez, Chess e Hadju em 1986, concluíram que as técnicas padrão de imuno- peroxidase, podem contribuir para a resolução de certos problemas de diagnóstico em citologia. No entanto, os resultados devem ser interpretados com prudência e com pleno conhecimento das limitações da técnica107.

Um estudo posterior de Koss, em 1990, contudo, demonstrou que a aplicabilidade da imunocitoquímica era condicionada pela fragilidade e baixa quantidade celular das amostras, verificando-se que nem sempre a interpretação dos resultados é fácil e a ocorrência de situações que podem levar a falsos positivos, é muito elevada108.

Num outro estudo, Flens e colaboradores, compararam os resultados de imunoci- toquímica com os de imunohistoquímica e concluíram que existiam uma elevada concordância (90%) entre estas metodologias, tendo estimado que em 50% dos casos, a imunocitoquímica contribuiu para um diagnóstico correto109.

Com o surgimento das técnicas de recuperação antigénica e com o aumento das capacidades ampliativas proporcionado pelos modernos sistemas de deteção, a imunocitoquímica tem-se tornado uma importante ferramenta de auxílio ao diag- nóstico citológico. Todavia, embora os resultados tenham melhorado ao longo dos últimos anos, ainda não atingiram os níveis de sucesso obtidos com a imunohisto- química de material biológico fixado em formaldeído e incluído em parafina110,111.

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11.2 Aplicação da imunocitoquímica

A análise de amostras citológicas baseia-se essencialmente na observação das ca- racterísticas morfológicas das células, pelo que a aplicação de técnicas de imunoci- toquímica constitui atualmente uma mais-valia, pois permite a caracterização mo- lecular, através da deteção de diversas proteínas que são identificadas através da reação antigénio-anticorpo112. Torna-se assim possível caracterizar neoplasias

pouco diferenciadas, definir a natureza primária ou metastática da lesão, determi- nar a origem das lesões metastáticas e avaliar o prognóstico113.

A ampla variedade de anticorpos que se encontra disponível para uso em tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina pode também ser usada nas amostras citológicas. Uma vez que a maioria das amostras citológicas são fixadas em álcool, a imunocitoquímica tem que ser capaz de atuar em amostras sujeitas a este tipo de fixação, o que se revela uma vantagem pois, com alguns anticorpos, obtém-se bons resultados nestas condições. No entanto, por serem frequentemente uma adapta- ção das técnicas utilizadas para caracterizar amostras histológicas, as técnicas aplicadas em amostra citológica podem apresentar resultados inconsistentes. A aplicação da imunocitoquímica possui a vantagem de permitir caracterizar anti- génios em células específicas que podem não ser observáveis em amostras histoló- gicas, todavia, a quantidade de material em citologia é frequentemente escassa e raramente se conseguem obter lâminas em grande quantidade com homogeneida- de de material celular, surgindo assim a dificuldade ou mesmo impossibilidade de se obter controlos externos.

Apesar do seu potencial único é importante ter presente que existem várias limita- ções para a aplicação da imunocitoquímica, destacando-se o facto dos anticorpos disponíveis no mercado estarem altamente optimizados para amostras histológi- cas fixadas em formaldeído e incluídas em parafina. Desta forma poderá ser útil em determinados casos processar o material citológico até ao bloco de parafina ou adaptar metodologias de fixação114,115.

As principais causas de falsos positivos e de falsos negativos em imunocitoquímica estão assim associadas a fatores que vão desde a degeneração celular típica das amostras citológicas até aos anticorpos menos otimizados para estas amostras116

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Tabela 8 – Principais causas de resultados falsos em imunocitoquímica.

Principais Causas

Falsos Positivos Células em autólise

Necrose

Intensa inflamação

Concentração elevada do anticorpo

Anticorpos pouco otimizados Falsos Negativos Falha técnica

Fixação alcoólica dificulta imunomarcação por alguns anticorpos

Variabilidade na sensibilidade dos anticorpos usados

11.3 Preparação de amostras

A imunocitoquímica pode ser aplicada em esfregaços convencionais, corados ou não, amostras citocentrifugadas, amostras processadas por método de monocama- da, ou ainda, amostras processadas até ao bloco de parafina 116,117.

As características mais importantes de cada uma destas metodologias vão desde a sua aplicabilidade quando o material é escasso até à dificuldade causada pelo tipo de fixação utilizado (Tabela 9).

Tabela 9 – Características das metodologias de preparação de amostras citológicas.

Pontos Positivos Pontos Negativos

Esfregaço Simples e pouco dispendioso Presença de fundo

Exigem grandes quantidades de an- ticorpo

Citocentrifugação Útil em casos de escasso material Presença de fundo

Necessidade de maior quantidade de material

Monocamada Menos fundo

Facilidade de acesso a material que se encontra armazenado

A fixação em metanol pode interfe- rir com alguns antigénios

Bloco parafina Uso de controlos

Material facilmente armazenado

Amostras com pouco material não podem ser usadas

11.3.1 Esfregaço convencional

Os esfregaços convencionais, por possuírem geralmente maior quantidade de célu- las, permitem a subdivisão de forma a serem aplicados vários anticorpos na mes- ma lâmina. No entanto, existe elevada probabilidade de ocorrência de imunomar- cação de fundo devido à presença de sangue, material necrosado, fluidos celulares ou diátese inflamatória. Outra desvantagem é a necessidade de uma grande quan- tidade de anticorpo para cobrir a amostra celular na sua totalidade110.

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11.3.2 Processamento em monocamada

O material citológico é atualmente processado com maior frequência de acordo com a metodologia monocamada que apresenta algumas vantagens para aplicação de técnicas de imunocitoquímica, pois o material é colhido diretamente para uma solução fixadora, prevenindo a ocorrência de artefactos de secagem e otimizando a preservação celular118 (Figura 89).

Figura 89 – Lâmina, filtro e embalagem de fixador utilizados para método monoca- mada.

Fonte:http://www.labosphera.eu/shop/

Adicionalmente, a transferência de material para a lâmina, numa reduzida área e em monocamada, facilita a interpretação microscópica da imunomarcação. Outra das vantagens do processamento em monocamada prende-se com o facto de per- mitir o armazenamento do material citológico até seis semanas após a colheita à temperatura ambiente, permitindo a preparação de lâminas adicionais119 (Figura

90).

Figura 90 – Amostra de Citologia Ginecológica. Esfregaço convencional (esquerda) e método monocamada (direita). Coloração de Papanicolaou, 100x.

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11.3.3 Processamento em bloco de parafina

Este tipo de processamento é aplicado em amostras citológicas, possibilitando a realização de técnicas complementares como a imunocitoquímica. Pode também ser um recurso quando existem biopsias de pequenas dimensões ou o material recolhido possui características mucóides, evitando assim perda de amostra. Este método apresenta como principais vantagens: possibilidade de processar a totalidade da amostra sem perda de material, concentração do material facilita a inclusão e a microtomia, conservação das amostras celulares em parafina e conse- quente arquivo por longos períodos de tempo. Além disso, parece aumentar a sen- sibilidade do diagnóstico citológico 120–122.

Existem várias metodologias diferentes de preparação destas amostras incluindo o

HistoGel, o Cellient automated cell block system ou o Cytoblock, mas não existe um

método eleito universalmente pelos diferentes laboratórios117.

Figura 91 – Histogel.

Fonte: http://www.berktree.com/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel-starter-kit-starter-kit.html

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