9 RECUPERAÇÃO ANTIGÉNICA
10.5 Causas de marcação inespecífica 5
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88 B. Interações iónicas.
C. Atividade enzimática endógena. D. Anticorpos naturais. E. Anticorpos contaminantes. F. Difusão antigénica. G. Reações cruzadas. H. Recetores Fc. I. Outros: a. Tecido necrosado b. Fixação deficiente c. Má desparafinação
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11 IMUNOCITOQUÍMICA
11.1 Enquadramento histórico
Tal como foi referido no início deste documento, considera-se imunocitoquímica o conjunto de metodologias que usam imuno-ensaios para co-localizar um epítopo de interesse em esfregaços citológicos, preparações citocentrifugadas (e.g. cytos-
pin™) ou preparações monocamada (e.g. thinprep®)1.
Em 1980, Nadji descreveu as potencialidades do diagnóstico imunocitoquímico, criando um método de imunoperoxidase ligeiramente modificado que aplicou em amostras de citologia aspirativa e esfoliativa, no sentido de avaliar a histogénese de células neoplásicas e diferenciar populações linfóides reativas e neoplásicas. Verificou que a técnica era exequível, permitindo uma boa morfologia, o que lhe pareceu justificar uma mais ampla aplicação desta metodologia no diagnóstico ci- tológico de rotina106.
Por sua vez, Chess e Hadju em 1986, concluíram que as técnicas padrão de imuno- peroxidase, podem contribuir para a resolução de certos problemas de diagnóstico em citologia. No entanto, os resultados devem ser interpretados com prudência e com pleno conhecimento das limitações da técnica107.
Um estudo posterior de Koss, em 1990, contudo, demonstrou que a aplicabilidade da imunocitoquímica era condicionada pela fragilidade e baixa quantidade celular das amostras, verificando-se que nem sempre a interpretação dos resultados é fácil e a ocorrência de situações que podem levar a falsos positivos, é muito elevada108.
Num outro estudo, Flens e colaboradores, compararam os resultados de imunoci- toquímica com os de imunohistoquímica e concluíram que existiam uma elevada concordância (90%) entre estas metodologias, tendo estimado que em 50% dos casos, a imunocitoquímica contribuiu para um diagnóstico correto109.
Com o surgimento das técnicas de recuperação antigénica e com o aumento das capacidades ampliativas proporcionado pelos modernos sistemas de deteção, a imunocitoquímica tem-se tornado uma importante ferramenta de auxílio ao diag- nóstico citológico. Todavia, embora os resultados tenham melhorado ao longo dos últimos anos, ainda não atingiram os níveis de sucesso obtidos com a imunohisto- química de material biológico fixado em formaldeído e incluído em parafina110,111.
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11.2 Aplicação da imunocitoquímica
A análise de amostras citológicas baseia-se essencialmente na observação das ca- racterísticas morfológicas das células, pelo que a aplicação de técnicas de imunoci- toquímica constitui atualmente uma mais-valia, pois permite a caracterização mo- lecular, através da deteção de diversas proteínas que são identificadas através da reação antigénio-anticorpo112. Torna-se assim possível caracterizar neoplasias
pouco diferenciadas, definir a natureza primária ou metastática da lesão, determi- nar a origem das lesões metastáticas e avaliar o prognóstico113.
A ampla variedade de anticorpos que se encontra disponível para uso em tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina pode também ser usada nas amostras citológicas. Uma vez que a maioria das amostras citológicas são fixadas em álcool, a imunocitoquímica tem que ser capaz de atuar em amostras sujeitas a este tipo de fixação, o que se revela uma vantagem pois, com alguns anticorpos, obtém-se bons resultados nestas condições. No entanto, por serem frequentemente uma adapta- ção das técnicas utilizadas para caracterizar amostras histológicas, as técnicas aplicadas em amostra citológica podem apresentar resultados inconsistentes. A aplicação da imunocitoquímica possui a vantagem de permitir caracterizar anti- génios em células específicas que podem não ser observáveis em amostras histoló- gicas, todavia, a quantidade de material em citologia é frequentemente escassa e raramente se conseguem obter lâminas em grande quantidade com homogeneida- de de material celular, surgindo assim a dificuldade ou mesmo impossibilidade de se obter controlos externos.
Apesar do seu potencial único é importante ter presente que existem várias limita- ções para a aplicação da imunocitoquímica, destacando-se o facto dos anticorpos disponíveis no mercado estarem altamente optimizados para amostras histológi- cas fixadas em formaldeído e incluídas em parafina. Desta forma poderá ser útil em determinados casos processar o material citológico até ao bloco de parafina ou adaptar metodologias de fixação114,115.
As principais causas de falsos positivos e de falsos negativos em imunocitoquímica estão assim associadas a fatores que vão desde a degeneração celular típica das amostras citológicas até aos anticorpos menos otimizados para estas amostras116
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Tabela 8 – Principais causas de resultados falsos em imunocitoquímica.
Principais Causas
Falsos Positivos Células em autólise
Necrose
Intensa inflamação
Concentração elevada do anticorpo
Anticorpos pouco otimizados Falsos Negativos Falha técnica
Fixação alcoólica dificulta imunomarcação por alguns anticorpos
Variabilidade na sensibilidade dos anticorpos usados
11.3 Preparação de amostras
A imunocitoquímica pode ser aplicada em esfregaços convencionais, corados ou não, amostras citocentrifugadas, amostras processadas por método de monocama- da, ou ainda, amostras processadas até ao bloco de parafina 116,117.
As características mais importantes de cada uma destas metodologias vão desde a sua aplicabilidade quando o material é escasso até à dificuldade causada pelo tipo de fixação utilizado (Tabela 9).
Tabela 9 – Características das metodologias de preparação de amostras citológicas.
Pontos Positivos Pontos Negativos
Esfregaço Simples e pouco dispendioso Presença de fundo
Exigem grandes quantidades de an- ticorpo
Citocentrifugação Útil em casos de escasso material Presença de fundo
Necessidade de maior quantidade de material
Monocamada Menos fundo
Facilidade de acesso a material que se encontra armazenado
A fixação em metanol pode interfe- rir com alguns antigénios
Bloco parafina Uso de controlos
Material facilmente armazenado
Amostras com pouco material não podem ser usadas
11.3.1 Esfregaço convencional
Os esfregaços convencionais, por possuírem geralmente maior quantidade de célu- las, permitem a subdivisão de forma a serem aplicados vários anticorpos na mes- ma lâmina. No entanto, existe elevada probabilidade de ocorrência de imunomar- cação de fundo devido à presença de sangue, material necrosado, fluidos celulares ou diátese inflamatória. Outra desvantagem é a necessidade de uma grande quan- tidade de anticorpo para cobrir a amostra celular na sua totalidade110.
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11.3.2 Processamento em monocamada
O material citológico é atualmente processado com maior frequência de acordo com a metodologia monocamada que apresenta algumas vantagens para aplicação de técnicas de imunocitoquímica, pois o material é colhido diretamente para uma solução fixadora, prevenindo a ocorrência de artefactos de secagem e otimizando a preservação celular118 (Figura 89).
Figura 89 – Lâmina, filtro e embalagem de fixador utilizados para método monoca- mada.
Fonte:http://www.labosphera.eu/shop/
Adicionalmente, a transferência de material para a lâmina, numa reduzida área e em monocamada, facilita a interpretação microscópica da imunomarcação. Outra das vantagens do processamento em monocamada prende-se com o facto de per- mitir o armazenamento do material citológico até seis semanas após a colheita à temperatura ambiente, permitindo a preparação de lâminas adicionais119 (Figura
90).
Figura 90 – Amostra de Citologia Ginecológica. Esfregaço convencional (esquerda) e método monocamada (direita). Coloração de Papanicolaou, 100x.
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11.3.3 Processamento em bloco de parafina
Este tipo de processamento é aplicado em amostras citológicas, possibilitando a realização de técnicas complementares como a imunocitoquímica. Pode também ser um recurso quando existem biopsias de pequenas dimensões ou o material recolhido possui características mucóides, evitando assim perda de amostra. Este método apresenta como principais vantagens: possibilidade de processar a totalidade da amostra sem perda de material, concentração do material facilita a inclusão e a microtomia, conservação das amostras celulares em parafina e conse- quente arquivo por longos períodos de tempo. Além disso, parece aumentar a sen- sibilidade do diagnóstico citológico 120–122.
Existem várias metodologias diferentes de preparação destas amostras incluindo o
HistoGel, o Cellient automated cell block system ou o Cytoblock, mas não existe um
método eleito universalmente pelos diferentes laboratórios117.
Figura 91 – Histogel.
Fonte: http://www.berktree.com/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel-starter-kit-starter-kit.html